PMSF的配置方法及注意事项

PMSF是丝氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶抑制剂。它抑制蛋白酶，如糜蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、巯基蛋白酶如凝血酶。PMSF抑制丝氨酸蛋白酶的磺化的丝氨酸残基的活性部位。

PMSF的配制方法：

溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml，分装成小份贮存于-20℃，使用时终浓度一般为1mmol/L。

使用介绍：

1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；

2）10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；

3）在室温可保存一年,一般保存在-20度或4度.；

4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~1mM），储存液浓度为100或200mM；

5）  在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h,补加一次。（见水分解，使用前加入）；

注意事项：

1.PMSF（苯甲基磺酰氟）溶解到异丙醇中，不能溶解到水中的。-20℃保存也会有结晶析出，这是正常的，等到温度稍高混匀就可以了。

2.PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一定要注意防护，手套和口罩。

3.一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

4.PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

5.PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

上海金畔生物科技有限公司活性氧检测试剂盒的原理及使用说明

活性氧介绍：

生物体内的自由基主要是指活性氧。所谓活性氧就是氧的某些中间代谢产物或含氧的衍生物质，具有比氧更强的氧化能力。在植物组织中，活性氧类型主要有：超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧和脂质过氧化自由基等。它们存在于植物细胞壁、叶绿体、线粒体、微粒体和细胞核等部位。在正常情况下，活性氧水平很低不会引起伤害，细胞内活性氧的产生与清除处于一种动态平衡状态。一旦这种平衡被打破，就可能产生伤害作用，首当其冲的就是膜系统，导致膜脂过氧化或脱脂化，膜差别透性丧失，离子大量外渗，引起一系列生理生化变化，代谢紊乱，严重时植物死亡。（摘自《活性氧检测的方法》——陈慧萍）

活性氧检测试剂盒原理：

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH 生成有荧光的DCF 。检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

活性氧检测试剂盒操作步骤：

一、装载探针：

对于刺激时间较短（通常为2 小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6 小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1 ∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μ mol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃细胞培养箱内孵育20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

 收集细胞后装载探针：按照1 ∶1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/mL ，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3 ～5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。

二、检测：

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

三、参数设置

使用488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF 。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图。

其它说明：阳性对照可以按照1 ∶1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL ，可以加入1 μ L的阳性对照刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1 ∶2000～1∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

活性氧检测试剂盒注意事项：

1.探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2.探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考上图。

3.尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养、试剂盒、实验耗材等产品。活性氧检测试剂盒为上海金畔生物科技有限公司常备货产品，是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

聚乙烯聚吡咯烷酮生物化学上的应用

聚乙烯聚吡咯烷酮

英文名称：PVPP ；Polyvinylpolypyrrolidone；

货号：P8070

聚乙烯聚吡咯烷酮是白色或近白色粉末，有微臭。不溶于水、乙醇、乙醚和常用有机溶剂。熔点大于300°C。具有吸湿性易流动的粉末，具有很强的膨胀性能和与多类物质的络合能力。

生物化学上的应用：

聚乙烯聚吡咯烷酮具有酰胺键可以吸附多酚分子上的氢氧基从而形成氢键，可以用于从水提物中吸收酚类和鞣酸以提纯植物酶；用作色谱吸附剂以分离芳香酸类、醛类、酚类等。 

存贮条件：室温干燥保存。

新一代核酸染料—GelRed 和GelGreen

要想获得安全的凝胶染料必须能清除或最小化染料和基因组DNA的相互作用。基于这种原则，科学家们结合物质的结构特点，开发出了一款不会渗透乳胶手套腈类手套和生物细胞膜的一种染料。

GelRed 和GelGreen是为代替高毒性的EB设计产生的新一代荧光核酸染料。由Biotium公司开发。相对于EB和其他的EB替代物，GelRed 和GelGreen有更多的优势：低毒性，高灵敏性，高稳定性。

EB由于其价格低和足够高的灵敏性，使其成为近几十年来最常用的核酸凝胶染料。但是EB是一种强诱变化学试剂。由于其存在的安全危害以及处理污染物所花费的大量金钱，使其使用变得并不廉价，也不再方便。基于这种原因，替代品开始出现，比如SYBR系列染料近年来开始应用于市场中。但这些产品虽然降低了危害性，却损失了产品的灵敏性和稳定性。比如SYBR Safe的灵敏性很低，SYBR Green和SYBR Gold相对于EB的稳定性要差很多。SYBR系列的染料也能进入细胞染色线粒体以及核内的DNA，从而产生危害。SYBR Green I已被证实在紫外光下将会产生强诱变能力，使DNA或其他物质发生突变（Ohta，et al.Mut Res 492,91(2001)）。

SYBR Safe则不能做到。此外，环境安全实验也显示GelRed 和GelGreen对水栖动物没有影响，因此GelRed 和GelGreen没有环境破坏性，使用后能做一般的处置。

GelRed 和GelGreen特点：

更安全：艾姆斯氏实验以及其他实验证实无诱变性无细胞毒性；

更方便处理：通过了环境安全实验，可以直接丢弃无需特殊处理。

超灵敏：比EB和SYBR Safe更灵敏。

更稳定：室温下，溶液中可稳定存在。

使用更方便：可预染也可后染。

与常用的仪器兼容：GelRed 可用EB常用仪器观察；GelGreen可用SYBR染料仪器进行观察。

可用于下游实验：普通的胶回收后，可用于下游实验。

                           EB                                                       GelRed

                    SYBR Safe                                    GelGreen

图1. GelRed 和GelGreen比EB和SYBR Safe更灵敏。左图：比较了GelRed 和EB 的1%预制胶，TBE缓冲液跑胶。右图：比较了GelGreen和SYBR Safe 1%琼脂糖凝胶的后染状况，同样在TBE缓冲液中完成。选用了Invitrogen的1 Kb的DNA Ladder作2倍稀释，分别加入四个泳道中，从左向右依次为200ng，100ng，50ng和25ng。

SYBR Safe                      GelRed                         GelGreen

图2. GelRed 和GelGreen更安全，因为它们不能穿过活细胞的细胞膜结合到DNA上。用1×SYBR Safe，GelRed 和GelGreen分别在37℃孵育Hela细胞。随后用FITC处理过的SYBR Safe和GelGreenGelRed 及Cy3处理GelRed孵育细胞。SYBR Safe很快进入细胞使核染色。GelRed 和GelGreen不能穿过细胞膜，不能观察到被染上色的细胞，仅在少量死亡的细胞中看到零星的荧光。