CMC柱层析分离血红蛋白的方法及注意事项

    CMC(CM Cellulose, 羟甲基纤维素钠)是一种阳离子交换树脂，是被广泛应用的离子交换树脂。下面介绍一下用羟甲基纤维素柱层析分离血红蛋白的方法。

    一、离子交换树脂的预处理

    称取CMC交换树脂8g，加10~20倍的0.5M NaOH 和0.5M NaCL等量混合浸泡24小时，然后用蒸馏水多次洗涤，然后再用柱层析的起始缓冲液（0.01M Ph6.5~6.7 磷酸缓冲液）浸泡12小时，使离子交换树脂和缓冲液充分达到平衡。

    二、上柱和洗涤

    预处理后的树脂，用起始缓冲液调成糊状，缓缓注入长度为30厘米，直径为1厘米的玻璃层析柱上，待树脂完全沉淀后，将层析柱顶部封住，并连接50毫升注射针筒加压至树脂紧密为止。然后连接装有起始缓冲液的加液器，以38mL/h，的流速洗涤树脂过夜。

    三、加样和洗脱

    按常规方法制成5%的血红蛋白溶液，并用起始缓冲液透析过夜。用吸管将2mL处理过的血红蛋白液延柱壁加入，待血红蛋白液渗入到与树脂面相平时，用吸管注入血红蛋白液2mL，随即封住柱顶，并连接加液装置，进行洗脱，洗脱液的pH值呈线性梯度增加。

    调节洗脱液的流速为12mL/h，用收集器收集，每管3mL，在415nm波长下比色，测定各管溶液的光密度，并每隔10管测定一次pH值。

    四、离子交换树脂的再生

    层析完成后，从柱中取出树脂，0.5M NaOH 和0.5M NaCL等体积混合通过布氏漏斗洗虑3次，再用蒸馏水洗至中性，然后再用起始缓冲液平衡12小时，即可再次使用。

    注意事项：

    1.交换树脂必须预处理充分，上柱后须用起始缓冲液洗涤至415nm的光密度接近于0；

    2.起始缓冲液的pH及梯度洗脱的pH应根据不同样品进行适当调整；

    3.分析的样品可用静脉血直接制成氧合血红蛋白溶液，或者通过一氧化碳制成碳氧血红蛋白溶液。

DMEM培养基的成份

DMEM是 dulbecco’s modified eagle medium的缩写,是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。所以其特点主要包括以下：
（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍,且含有非必需氨基酸,如甘氨酸等；
（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；
（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；
（4）含有微量的铁离子.Eagle来自该培养基的发明人Harry Eagle

1640和DMEM培养基的区别

1640培养基和DMEM培养基在组分和用途上有区别，主要是组分上的区别，查各自的配方表可知。用途上这两种培养基应用都很广泛，且都适合很多种细胞的培养。
    RPMI 1640主要用于悬浮细胞培养。可适用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养。其它像K-562、HL-60、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。
    DMEM适用于贴壁细胞生长，如各种实体瘤贴壁细胞。

DMEM培养基的成份如图下:

上海金畔生物科技有限公司是一家集产品研发、生产、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。DMEM培养基为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为12100-500。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

Western Blot内参抗体选择原则

内参抗体 种类很多，比如beta-actin、beta-tubunlin、GAPDH、α-tubunlin等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：

一.样本种属来源：

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

1、哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。

2、植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3、其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白 作为内参。

二.目的蛋白分子量 ：

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子 量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

三.目的蛋白表达 部位：

就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参;而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。