荧光定量 PCR 方法：探针法 VS 染料法？

荧光定量 PCR 又称 qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。

大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct 值）。从理论上说，起始模板量和 Ct 值密切相关，因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定量。

在进行荧光定量 PCR 时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是方法的选择，对最终结果的准确性至关重要。荧光定量 PCR 从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。

一、染料法

在国内，染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ，染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量 PCR 实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，会极大的影响真实结果的准确性。为此，一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。

二、TaqMan 探针法

TaqMan 探针法 PCR 扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（FAM 或 Hex 等）和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；当 PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5′ -3′ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。

探针法与染料法的最大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列，也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外，人们还可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的目的。在样本量比较大的情况下，成本甚至可以低于染料法。

因此我们可以看到，在选择荧光定量实验时，探针法在特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法，但在实际使用时，TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却步。目前，上海捷瑞生物工程有限公司在强大的探针合成能力的前提下，推出了探针法荧光定量 PCR 服务，以染料法的价格，享受探针法的服务，在相同的经费情况下，提高实验的准确性和特异性。

膜再生液的具体作用有哪些

膜再生液又称为Western抗体洗脱液，常用于Western中转移了蛋白的膜的重复利用。适用于Western化学发光检测后的蛋白膜的重复利用，尤其适用于PVDF膜，其次为硝酸纤维素膜。那么膜再生液的作用具体有哪些呢？

膜再生液的作用：

使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。使用膜再生液可以对同一张膜进行多次WESTERNBLOT检测。在室温条件下，将用过的膜浸泡在膜再生液10-60分钟，可在不影响抗原蛋白的情况下清除膜上结合的抗体。随后，可以使用不同的抗体进行下一轮WESTERNBLOT实验。适宜从少量样品多次检测不同蛋白质。即使样品量并不匮乏，采用这一策略多次检测同一张膜上的蛋白，能省去给药处理、蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤。而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。适用于清除硝酸纤维素膜或PVDF膜上结合的抗体，不影响抗原蛋白。

以上就是膜再生液的作用，但是由于重复使用，蛋白信号会有一定减弱，可以适当多用几次。

油红O染色步骤有哪些

油红O染色液主要由油红O异丙醇饱和液组成，利用染料易溶于脂质的性质证明组织脂质含量的多少。适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。染色后脂滴呈橘红色。下面来了解一下油红O染色步骤有哪些。
油红O染色步骤
试剂:
0.5%的油红O溶液
配方(100ml)： 油 红O ： 1.5g
70%乙醇 ： 50ml
丙酮 ： 50ml
需要的其他试剂：异丙醇、乙醇、丙酮、苏木素（hematoxylin）
油红O染色步骤:
1．将冰冻切片(厚度为4-8um)常温干燥15-20min.
2．100%异丙醇孵育5分钟（避免把水带入油红O）。
3．0.5%的油红O溶液孵育7-8分钟（在60 oC烤箱）
4．85%异丙醇溶液洗3分钟
5．双脱水洗。
6．苏木素染1-1.5min。
7．双脱水洗。
8．封片剂封片
结果: 脂质呈红色或者橘黄色
细胞核呈淡蓝色
油红O染色步骤注意事项：
1 由于脂肪易溶于有机溶剂，所以一般用冰冻切片染色来显示。
2 作脂肪染色的冰冻切片不能太薄，过薄的切片常会使脂质丢失。
3 苏木素复染时间不能过长。
4 染色结果不能长期保存，应尽快观察。

以上便是油红O染色步骤，油红O染色常用作染脂肪。脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。脂类染色，用冰冻或石蜡切片，以水溶性封固剂封固，如甘油明胶和阿拉伯糖胶等。

麦芽汁琼脂培养基配方

 麦芽汁琼脂培养基英文名称为Malt Extract Agar，此培养基的主要用于酵母菌的培养、鉴定及保存菌种。  

麦芽汁琼脂培养基配方成分(g/L)

麦芽浸粉                  130.0

氯霉素                      0.1

琼脂                       15.0

pH值6.0 ± 0.2            25℃

上海金畔生物科技有限公司备有现货产品麦芽汁琼脂培养基，货号为M8570，常买规格为250g，主要用于用于霉菌和酵母菌计数。

关于上海金畔生物科技有限公司中性树胶的作用和使用

中性树胶是将载玻片和盖玻片粘合在一起的一种粘合剂，用于长久保留生物组织切片封存。中性树胶透明度高，几乎和光学玻璃一样清晰。该货品属中性，不会腐蚀玻璃。如果不放心可以在粘合以前用盐酸酒精泡一泡，晒干再粘合会更好。

中性树胶是显微技术上使用的优良封藏剂，与加拿大树胶性质相似，用途相同。中性树胶是一种天然树胶，经提炼与中和后溶解在二甲苯中成60%溶液，折光率与玻璃近似，干燥后凝结成透明无色的固体，没有收缩变黄、纹裂的弊病，没有像加拿大树胶有年久变黄切片氧化退色等缺点。切片标本有苏木精、曙红、番红、固绿、洋红染色的，保藏数年颜色无变化。许多整装标本如吸血虫、涤虫等寄生虫，用中性树胶封固，均能取得优良效果。

中性树胶的使用方法

封片方法很简单，在载玻片中央滴2-3滴树胶液，然后把盖玻片慢慢放上去，轻轻挤压，树胶液会向外侧扩散至整个镜片，通风晾几个小时后用棉球粘上二甲苯或者松节油把镜片边缘多余的树胶擦洗干净。然后再放在通风处晾干，然后再放在通风处晾2个月。不过可能在烈日下暴晒会快点。封片可常温保存。

中性树胶的注意事项

1、二甲苯有毒，避免与皮肤或眼睛接触。

2、载玻片中央滴树胶液要滴在一起，否则容易起气泡

3、中性树胶是以二甲苯为溶剂的，封合后挥发很慢，制作的玻片起码在通风处晾一两个月才没有二甲苯的味道。

关于中性树胶的问与答

问：用中性树胶封片，时间长了会不会变黄或发霉？

答：不中性树胶封片不容易长霉，可能是因为中性树胶的溶剂二甲苯有杀霉菌作用。

问：中性树胶怎么稀释？用什么稀释最好？

答：稀释中性树胶要加稀释液，使用二甲苯最好，但是二甲苯有毒，使用时要注意不要与皮肤或眼睛接触。

问：石蜡切片封片用的树胶很久不用，凝固了，应该怎样才能再成液态？

答：可用二甲苯溶解。

问：中性树胶封片不好，有气泡，还弄到了玻片背面。请问，能洗掉重新封吗？

答：可以的，放到二甲苯里泡，不过要小心点操作，让盖玻片滑下来，不要硬掀起来，以防把组织也一块掀下来。也可以等泡好了,就轻轻的在二甲苯中抖动,让盖玻片自然掉下。当你把盖玻片泡下来了后,不要马上又封片,因为切片上还有一些中性树脂,会影响以后镜下观看。盖玻片掉了后，拿起切片在里面搅，尽量把树脂洗掉。

问：切片染色后用中性树胶封片的原因是树胶与玻璃的折射率几乎相等还是树胶的折射率比玻璃大？

答：中性树胶与玻璃的折射率几乎相等的。

问：在用中性树胶封片时不小心弄到的手上，怎么洗掉？

答：中性树胶一般用强化学试剂去除，但这些试剂均有毒。你是粘在手上，那没办法，只有用刀一点点小心刮去。不过树胶过不了多久自己会掉的，一天过去就没什么了。

北京上海金畔生物科技有限公司科技有限公司长期备货中性树胶，货号为G8590，常卖规格为100ml。其透明度和光学玻璃一样清晰，不会影响切片标本的观察。目前中性树胶广泛使用在生物学，医学作为生物切片封藏剂，以及光学琉璃仪器的粘固剂。