上海金畔生物科技有限公司活性氧检测试剂盒的原理及使用说明
活性氧介绍：
生物体内的自由基主要是指活性氧。所谓活性氧就是氧的某些中间代谢产物或含氧的衍生物质，具有比氧更强的氧化能力。在植物组织中，活性氧类型主要有：超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧和脂质过氧化自由基等。它们存在于植物细胞壁、叶绿体、线粒体、微粒体和细胞核等部位。在正常情况下，活性氧水平很低不会引起伤害，细胞内活性氧的产生与清除处于一种动态平衡状态。一旦这种平衡被打破，就可能产生伤害作用，首当其冲的就是膜系统，导致膜脂过氧化或脱脂化，膜差别透性丧失，离子大量外渗，引起一系列生理生化变化，代谢紊乱，严重时植物死亡。（摘自《活性氧检测的方法》——陈慧萍）
活性氧检测试剂盒原理：
活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH 生成有荧光的DCF 。检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
活性氧检测试剂盒操作步骤：
一、装载探针：
对于刺激时间较短（通常为2 小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6 小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1 ∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μ mol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL 。37℃细胞培养箱内孵育20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1 ∶1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/mL ，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3 ～5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
二、检测：
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
三、参数设置
使用488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF 。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下图。
其它说明：阳性对照可以按照1 ∶1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL ，可以加入1 μ L的阳性对照刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1 ∶2000～1∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
活性氧检测试剂盒注意事项：
1.探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2.探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考上图。
3.尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养、试剂盒、实验耗材等产品。活性氧检测试剂盒为上海金畔生物科技有限公司常备货产品，是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
