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sgRNA体外转录和筛选酶试剂盒Takara Clontech

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上海金畔生物科技有限公司代理Takara Clontech酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

sgRNA体外转录和筛选
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Clontech 632635 Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit 50 Rxns ￥8,771
￥7,017 		sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选
Clontech 632636 Guide-it Complete sgRNA Screening System 50 Rxns ￥10,701
￥8,561 		sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选
Clontech 632639 Guide-it sgRNA Screening Kit 50 Rxns ￥4,810
￥3,848 		sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选
Clontech 632638 Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit 50 Rxns ￥4,439 sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选 sgRNA体外转录和筛选

*红字为促销价格，促销时间: 2022年9月1日-2022年10月31日

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sgRNA的体外转录和筛选试剂盒
In Vitro Transcription and Screening Kits for sgRNA
我们的Guide-it in vitro transcription and screening kits for sgRNA 包括四个试剂盒，用于CRISPR/Cas9 研究中单链向导RNAs(single guide RNAs ,sgRNAs)的简单制备、清理和评价。每个试剂盒提供足够 50次反应的材料。
· Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635) 被用于通过体外转录制备大量的 sgRNAs。这个试剂盒同样包括Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638), 被用于快速纯化参与体外转录（vitro transcription，IVT) 反应的sgRNA。从这个试剂盒纯化后的 sgRNA 可以直接被用于转染、电穿孔以及体外剪切实验。
· Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639) 可以在Cas9介导的基因编辑相关研究前，先在体外检测不同sgRNAs的效率，这样就不必浪费时间将无效的sgRNAs转入您的细胞了。使用这个试剂盒，首先通过PCR产生包含sgRNA靶点的模板，随后再与您想测试的sgRNA以及重组Cas9核酸酶结合。Cas9 核酸酶剪切模板的效率可以通过使用琼脂糖凝胶电泳检测。
· Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636) 包含以上提到的全部试剂盒组分，可以被用来合成和检测sgRNAs效率。该试剂盒包含了用于体外转录和纯化sgRNAs，以及检测重组Cas9核酸酶对PCR靶向片段剪切效率的所有试剂。
 
■ 产品特点
· 共有4个试剂盒，可用于Cas9介导的基因编辑研究中sgRNA (single guide RNA)的简单制备、清洁以及效率评价。
· Lenti-X Packaging Single Shots易于产生高滴度病毒。
· 使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 包括Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit, Code No. 632638)体外转录和纯化大量sgRNA，用于转染或体外筛选。
· 使用Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638) 对IVT 反应后sgRNA的快速纯化，直接用于转染、电穿孔以及体外剪切试验。
· Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639)包含高质量的重组Cas9蛋白质。
· Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636)是Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635) 和 Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639)的组合，允许您进行sgRNA制备和对预设靶点体外剪切能力的测试。
 
■ 实验例
sgRNA体外转录和筛选
图1. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening System试剂盒组成和操作流程
 
sgRNA体外转录和筛选
图2. 采用Guide-it试剂盒制备高产量single guide RNA (sgRNA)和重组Cas9蛋白质剪切靶位点检测sgRNA剪切效率操作步骤概要
 
sgRNA体外转录和筛选
图3. Guide-it试剂和同类产品所制备的sgRNA品质比较
采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的所有sgRNAs均为单一条带，而其他公司同类产品制备的sgRNAs均可观察到杂带，因此Guide-it试剂盒所制备的sgRNAs品质更高。
* 比较结果来自于Takara Bio USA, Inc.
 
sgRNA体外转录和筛选
图4. 以不同基因为靶标制备的sgRNA产量和品质比较
采用Guide-it Complete sgRNA Screening System以多个基因为靶基因制备sgRNA。
Panel A. 将20 μl sgRNA体外转录（IVT）反应液置于37°C孵育4 hr，采用NanoDrop分光光度计检测所制备产生的sgRNA产量。
Panel B. 采用安捷伦生物分析仪分析分析每一个sgRNA IVT反应液，检测sgRNA质量。
 
■ 产品组份
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 50 rxns)
· 1 each Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2 (Code No. 632637; 50 rxns; Not sold separately)
    ○ 50 μl Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl)
    ○ 350 μl Guide-it In Vitro Transcription Buffer
    ○ 1 ml RNase Free Water
    ○ 500 μl RNase Free Water
    ○ 150 μl Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl)
    ○ 625 μl PrimeSTAR Max Premix (2X)
    ○ 100 μl Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl)
· 1 each Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638; 50 rxns)
    ○ 13 ml RNase Free Water
    ○ 3 ml IVT Binding Buffer
    ○ 50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
    ○ 2 x 6 ml IVT Wash Buffer
    ○ 50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it sgRNA Clean-Up Kit (Code No. 632638; 50 rxns)
· 13 ml RNase Free Water
· 3 ml IVT Binding Buffer
· 50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
· 2 x 6 ml IVT Wash Buffer
· 50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639; 50 rxns)
· 25 μl Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl)
· 50 μl 15X Cas9 Reaction Buffer
· 50 μl 15X BSA
· 5 μl Control sgRNA (50 ng/μl)
· 25 μl Control Fragment (20 ng/μl)
· 50 μl Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl)
· 1.25 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
· 5 ml RNase Free Water
· 5 ml Extraction Buffer 1
· 0.5 ml Extraction Buffer 2

Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636; 50 rxns)
· Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635)
· Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639)

 
 
 
■ 关联资料
点击查看Guide-it™ sgRNA体外转录和筛选系统宣传页 sgRNA体外转录和筛选
 
 
产品详情请点击：sgRNA体外转录和筛选
 

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sgRNA体外转录和筛选
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
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Clontech 632639 Guide-it sgRNA Screening Kit 50 Rxns ￥4,810
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sgRNA的体外转录和筛选试剂盒
In Vitro Transcription and Screening Kits for sgRNA
我们的Guide-it in vitro transcription and screening kits for sgRNA 包括四个试剂盒，用于CRISPR/Cas9 研究中单链向导RNAs(single guide RNAs ,sgRNAs)的简单制备、清理和评价。每个试剂盒提供足够 50次反应的材料。
· Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635) 被用于通过体外转录制备大量的 sgRNAs。这个试剂盒同样包括Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638), 被用于快速纯化参与体外转录（vitro transcription，IVT) 反应的sgRNA。从这个试剂盒纯化后的 sgRNA 可以直接被用于转染、电穿孔以及体外剪切实验。
· Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639) 可以在Cas9介导的基因编辑相关研究前，先在体外检测不同sgRNAs的效率，这样就不必浪费时间将无效的sgRNAs转入您的细胞了。使用这个试剂盒，首先通过PCR产生包含sgRNA靶点的模板，随后再与您想测试的sgRNA以及重组Cas9核酸酶结合。Cas9 核酸酶剪切模板的效率可以通过使用琼脂糖凝胶电泳检测。
· Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636) 包含以上提到的全部试剂盒组分，可以被用来合成和检测sgRNAs效率。该试剂盒包含了用于体外转录和纯化sgRNAs，以及检测重组Cas9核酸酶对PCR靶向片段剪切效率的所有试剂。
 
■ 产品特点
· 共有4个试剂盒，可用于Cas9介导的基因编辑研究中sgRNA (single guide RNA)的简单制备、清洁以及效率评价。
· Lenti-X Packaging Single Shots易于产生高滴度病毒。
· 使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 包括Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit, Code No. 632638)体外转录和纯化大量sgRNA，用于转染或体外筛选。
· 使用Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638) 对IVT 反应后sgRNA的快速纯化，直接用于转染、电穿孔以及体外剪切试验。
· Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639)包含高质量的重组Cas9蛋白质。
· Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636)是Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635) 和 Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639)的组合，允许您进行sgRNA制备和对预设靶点体外剪切能力的测试。
 
■ 实验例
sgRNA体外转录和筛选
图1. Guide-it sgRNA In Vitro Transcription and Screening System试剂盒组成和操作流程
 
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图2. 采用Guide-it试剂盒制备高产量single guide RNA (sgRNA)和重组Cas9蛋白质剪切靶位点检测sgRNA剪切效率操作步骤概要
 
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图3. Guide-it试剂和同类产品所制备的sgRNA品质比较
采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的所有sgRNAs均为单一条带，而其他公司同类产品制备的sgRNAs均可观察到杂带，因此Guide-it试剂盒所制备的sgRNAs品质更高。
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图4. 以不同基因为靶标制备的sgRNA产量和品质比较
采用Guide-it Complete sgRNA Screening System以多个基因为靶基因制备sgRNA。
Panel A. 将20 μl sgRNA体外转录（IVT）反应液置于37°C孵育4 hr，采用NanoDrop分光光度计检测所制备产生的sgRNA产量。
Panel B. 采用安捷伦生物分析仪分析分析每一个sgRNA IVT反应液，检测sgRNA质量。
 
■ 产品组份
Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 50 rxns)
· 1 each Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Components v2 (Code No. 632637; 50 rxns; Not sold separately)
    ○ 50 μl Guide-it Scaffold Template (1 ng/μl)
    ○ 350 μl Guide-it In Vitro Transcription Buffer
    ○ 1 ml RNase Free Water
    ○ 500 μl RNase Free Water
    ○ 150 μl Guide-it T7 Polymerase Mix (33 U/μl)
    ○ 625 μl PrimeSTAR Max Premix (2X)
    ○ 100 μl Recombinant DNase I (RNase-Free) (5 U/μl)
· 1 each Guide-it IVT RNA Clean-Up Kit (Code No. 632638; 50 rxns)
    ○ 13 ml RNase Free Water
    ○ 3 ml IVT Binding Buffer
    ○ 50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
    ○ 2 x 6 ml IVT Wash Buffer
    ○ 50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it sgRNA Clean-Up Kit (Code No. 632638; 50 rxns)
· 13 ml RNase Free Water
· 3 ml IVT Binding Buffer
· 50 IVT RNA Clean-Up Spin Columns
· 2 x 6 ml IVT Wash Buffer
· 50 Collection Tubes (2 ml)

Guide-it sgRNA Screening Kit (Code No. 632639; 50 rxns)
· 25 μl Guide-it Recombinant Cas9 Nuclease (500 ng/μl)
· 50 μl 15X Cas9 Reaction Buffer
· 50 μl 15X BSA
· 5 μl Control sgRNA (50 ng/μl)
· 25 μl Control Fragment (20 ng/μl)
· 50 μl Terra PCR Direct Polymerase Mix (1.25 U/μl)
· 1.25 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
· 5 ml RNase Free Water
· 5 ml Extraction Buffer 1
· 0.5 ml Extraction Buffer 2

Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code No. 632636; 50 rxns)
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Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备酶试剂盒Takara Clontech

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Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Clontech 632612 Guide-it CRISPR/Cas9 Vector System 1 System ￥4,641 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
Clontech 632613 Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System 1 System ￥9,225 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
Clontech 632616 Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set 10 Rxns ￥7,076 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
Clontech 632617 Gesicle Producer 293T Cell Line 1 ml ￥7,650 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备 Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
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Guide-it™CRISPR/Cas9 Gesicle Production System
· 细胞来源的纳米囊泡（Gesicle），可用于直接导入Cas9-sgRNA
· 转染效率低的哺乳动物细胞（分裂細胞、非分裂細胞、iPS細胞）也可实现有效的基因编辑
· Cas9蛋白质/sgRNA复合物可以快速从细胞内消除，降低脱靶效应
 
■ 产品说明：
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System用于制备Cas9/sgRNA Gesicle，Cas9/sgRNA Gesicle是可以将Cas9蛋白质/sgRNA复合物导入到哺乳动物细胞的细胞来源的纳米囊泡（Gesicle）。与采用质粒或者病毒载体相比较，采用Cas9/sgRNA Gesicle进行基因编辑实验，可以实现在广泛细胞类型中高效导入Cas9蛋白质/sgRNA复合物，从而提高基因编辑效率。同时，可以严格控制用于细胞的Cas9蛋白质/sgRNA复合物的剂量和持续时间，从而降低脱靶效应。
 
■ CRISPR／Cas9 Gesicle特点：
· 适用于多种细胞类型
   可在分裂细胞、非分裂细胞、原代细胞、细胞株、iPS细胞等多种细胞类型中进行基因编辑（图4）
· 高活性Cas9蛋白质／sgRNA确保有效的细胞导入
   Cas9蛋白质／sgRNA直接导入细胞，无需转录和翻译过程，导入后可以直接开始基因编辑
· 实现在需要的时候进行基因编辑
   可以严格控制Cas9蛋白质/sgRNA复合物的剂量和持续时间，与采用质粒或者病毒载体导入系统进行
   基因编辑相比较，降低了脱靶效应
 
■ CRISPR／Cas9 Gesicle原理：
Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
图1． Cas9/sgRNA Gesicle制备和靶细胞导入
 
(Step 1) 将诱导Gesicle形成的质粒预混液，靶特异sgRNA表达载体和Cas9表达载体共转染至Gesicle Producer 293T Cell Line (Code No. 632617)中。(Step 2) 利用Clontech iDimerize系统技术原理，借助与gesicle表面的膜结合红色荧光蛋白质CherryPicker之间的相互作用， iDimerize诱导配体将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物载入到gesicle中。(Step 3) 携带红色荧光标记的Gesicle装配完成并从制备细胞中释放出来，收集培养基上清液，获得Cas9-sgRNA Gesicle浓缩储液。(Step 4) 收集获得的Gesicle适用于广泛细胞类型，可将靶细胞瞬时标记为红色并将Cas9-sgRNA复合物释放至靶细胞中。由于Cas9蛋白质C端有核定位信号（NLS），同时靶细胞培养液中没有dimerizer诱导配体，因此可以确保Cas9-sgRNA复合物与红色荧光蛋白质分离之后可以转运至细胞核内。
 
Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
图2．Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System实验流程
 
■ 实验例
Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
图3. 脱靶效应比较
 
比较采用Cas9-sgRNA Gesicle和质粒系统导入sgRNA所带来的脱靶效应。凝胶电泳结果、Guide-it™ Mutation Detection Kit检测结果以及测序结果均表明，采用Cas9-sgRNA Gesicle导入sgRNA时在潜在脱靶位点检测不到明显的脱靶效应，而采用质粒系统导入sgRNA时在靶基因位点EMX1和潜在脱靶位点均可检测到基因突变。
 
Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
图4. 不同细胞类型中基因敲除效率比较
 
建立整合ZsGreen1表达框的不同细胞系，采用Cas9-sgRNA Gesicle（sgRNA以ZsGreen1为靶基因）处理细胞系，流式细胞仪进行结果分析。以添加不同量的ZsGreen1为靶基因的Cas9-sgRNA Gesicle（添加量分别为10 μl、20 μl、30 μl）处理组为实验组、以转染Cas9/sgRNA表达质粒处理组作为对照组，流式细胞仪检测基因敲除效率。
在Jurkat等难转染细胞类型中，Cas9-sgRNA Gesicle的Cas9-sgRNA导入效率和ZsGreen1基因敲除效率要优于Cas9/sgRNA表达质粒。
 
Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
图5.成功敲除hiPS细胞中的CD81基因
 
以人CD81为靶标设计sgRNA，采用Gesicle Producer 293T Cell Line制备产生含有Cas9-sgRNA复合物的细胞纳米囊泡，收集Cas9-sgRNA Gesicle并将其添加至48孔板培养的未分化Cellartis human iPS cell line 18（Code No. Y00305）。Cellartis human iPS cell line 18以Cellartis DEF-CS Culture System（Code No. Y30010）为培养体系，培养6 hr和24 hr后更换为不含有Gesicle的DEF-CS培养基继续培养7天。未添加Gesicle处理并且采用相同培养条件培养的Cellartis human iPS cell line 18作为实验对照组。通过流式细胞仪检测经Gesicle处理和未经Gesicle处理的Cellartis human iPS cell line 18, 采用FITC标记的CD81抗体检测细胞表面CD81的表达情况。
Panel A. 未经处理的Cellartis human iPS cell line 18（左）和FITC标记的CD81抗体检测未经Gesicle处理的Cellartis human iPS cell line 18（右）。 Panel B. FITC标记的CD81抗体检测经Gesicle处理6 hr（左）和24 hr（右）的Cellartis human iPS cell line 18。
流式细胞仪检测结果表明， 经Cas9/sgRNA Gesicle处理6 hr 后，CD81基因敲除效率为43%；经Cas9/sgRNA Gesicle处理24 hr 后，CD81基因敲除效率为49%。
 
■ 产品组份
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System（Code No. 632613）
1. Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set（ Code No. 632616）
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1 (green cap) 10 vials
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2 (yellow cap) 10 vials
A/C Heterodimerizer (500 nM in Ethanol) 50 μl
Protamine Sulfate (4 mg/ml) 200 μl
 
2. pGuide-it-sgRNA1 Vector System（ Code No. 632612）
a．pGuide-it-sgRNA1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl) 20 μl
b．Guide-it Ligation Components v2  
    DNA Ligation Mighty Mix 50 μl
    Guide-it Oligo Annealing Buffer 1.5 ml
    Guide-it Control Annealed Oligos v2 (100 fmol/μl) 10 μl
    Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) 10 μl
    PCR-Grade Water 1 ml
c．Stellar Competent Cells（ Code No. 636763）  
    Stellar Competent Cells (100 μl/tube) 10 tubes
    SOC Medium (1 ml/tube) 10 tubes
    pUC19 Vector (0.1 ng/μl) 10 μl
 
Gesicle Producer 293T Cell Line（Code No. 632617）
Gesicle Producer 293T Cell Line 1 ml
 
■ 保存
Stellar Competent Cells：－80℃
其它：－20℃

Gesicle Producer 293T Cell Line :液氮保存
· 收到产品后，立即将其保存在液氮中。
· 在液氮保存的情况下，立即复苏细胞进行细胞培养。
 
■ 所需要的其它产品（主要产品）
· 0.45 μm 无菌过滤器（cellulose acetate或者polysulfonate）
· 20 ml 无菌注射器
· 50 ml 离心管 (Corning Falcon Cat. No. 352017等)
· 离心机、摆动转子（50 ml 离心管可以满足8,000X g离心要求）（例如：离心机Beckman J2-HS、摆动转子 JS-7.5 swinging bucket rotor）
· 不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco’s PBS（用于细胞培养）（Sigma Cat. No. D8537等)
· 细胞培养液
· 胶原蛋白质预包被培养板
 
产品详情请点击：Cas9-sgRNA细胞纳米囊泡制备
 
 

CRISPR全基因组sgRNA文库系统酶试剂盒Takara Clontech

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CRISPR全基因组sgRNA文库系统
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Clontech 632646 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System 5 Screens ￥21,144 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
Clontech 632647 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit 10 Rxns ￥7,004 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
Clontech 632651 Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit 20 Rxns ￥3,445 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统 CRISPR全基因组sgRNA文库系统
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CRISPR全基因组sgRNA文库系统 → CRISPR全基因组sgRNA文库系统 → CRISPR全基因组sgRNA文库系统 → CRISPR全基因组sgRNA文库系统 → CRISPR全基因组sgRNA文库系统
 
 
注意：购买632646产品时，需要填写专利确认书
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
· 包含超过76,000条基于Brunello文库的sgRNAs，既可以实现更高的靶向特异性和靶向活性，
   同时也可以保持很低的脱靶效应点击下载sgRNA representation data.
· 每一个人类基因对应4条高活性sgRNAs, 可以通过单一模块进行筛选
· 优化后的sgRNA scaffold有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用，实现高基因编辑效率
· 慢病毒sgRNA文库已与Lenti-X Packaging Single Shots和Xfect Transfection Reagent
   配制在一起，因此只需要加入水就可以获得高效转染混合液，用于转染Lenti-X 293T cells
   制备高滴度慢病毒sgRNA文库
· 自失活慢病毒载体保证慢病毒制备和使用过程中高水平的生物安全性
 
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System可以使用CRISPR/Cas9在人细胞中轻松实现全基因组表型敲除筛选。Lenti-X Single Shots包含了全基因组sgRNA文库和Cas9表达系统，可方便制备出稳定表达Cas9和sgRNA文库的细胞系进行每一次筛选。该sgRNA文库是基于Brunello文库 (Doench et al. 2016; Doench, 2018) 所构建的，包含了超过76,000条向导RNA以及非靶向sgRNA对照，每一个人类基因对应4条高效率sgRNAs，可对大约19,000个基因进行有效筛选。文库筛选后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit制备NGS样品进行新一代测序分析，此试剂盒包含了以sgRNA文库转导后的细胞来制备NGS样品所必需的引物和试剂。
 
我们精心构建这个sgRNA文库以确保其固有的sgRNA代表性。在文库合成、扩增、病毒制备和靶细胞转导每一步操作过程中，我们都会对sgRNA代表性进行检测。Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含经过验证的构建在慢病毒载体上的sgRNA文库和Lenti-X 293T cells，这个sgRNA文库以脱水形式提供。只需要添加水至冻干的文库混合物中就可以获得高效转染混合液，然后将混合物添加至293T细胞的培养液中进行转染就可以制备获得慢病毒粒子。每一批sgRNA文库都通过NGS进行了检测，确保超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列，有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用，实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots，可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。
 
应用：
· 人细胞全基因组表型筛选
· 功能缺失型遗传筛选
 
注意事项：
· Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit (Code No. 632651) 包含了扩增sgRNA进行
   NGS分析的所有引物和试剂，起始样品为从筛选出的细胞群分离提取的基因组DNA，
   此试剂盒可用于制备10个测序文库（20 PCRs）。
· Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit (Code No. 632647)包含
   Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit和基因组DNA纯化试剂以及PCR产物纯化试剂。
 
参考文献：
Doench, J.G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nat. Rev. Genet.19, 67 80 (2018).
Doench, J.G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184 191 (2016).
 
Technical Notes
CRISPR全基因组sgRNA文库系统 Performing a phenotypic screen using the Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System
 
CRISPR screening webinar
Lentiviral CRISPR/Cas9 knockout screening made simple
 
 
实验例：
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图1 Guide-it CRISPR sgRNA文库所使用的载体和sgRNA scaffold示意图。Panel A. 从pLVXS-EF1a-Cas9-PGK-Puro和pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg 载体图谱中我们可以观察到所使用的慢病毒载体骨架。这些慢病毒载体经过了自失活处理，以提高病毒制备和使用过程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体包含一个IRES连接的双顺反子表达框，可以同时表达mCherry红色荧光标记和潮霉素抗性筛选标记。sgRNAs由人U6启动子表达，包含经过优化的scaffold序列，可以高效招募Cas9，实现更高的基因编辑效率(Panel B)。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图2 通过mCherry红色荧光判断慢病毒sgRNA文库的转导效率。按照用户手册的指导来制备慢病毒sgRNA文库，转染48小时后收集慢病毒粒子，以不同的MOIs转导表达Cas9的A375细胞。接种培养转导后的细胞，转导48小时后通过荧光显微镜和FACS 检测转导效率。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图3 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含的sgRNA代表性分析。Panel A. 质粒文库中的sgRNA代表性分析。将基于Brunello的sgRNA文库克隆至pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体并进行扩增，通过NGS验证这个质粒文库中的sgRNAs代表性。检测结果显示，这个文库中超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。图表中的柱形表示具有特定读段数的sgRNA数量。Panel B. 比较质粒文库和转导细胞中的sgRNA代表性。以潮霉素为筛选标记，筛选出Cas9+/sgRNA+ A375细胞，提取基因组DNA并进行PCR扩增。测序分析PCR产物，检测PCR产物中每一个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA文库的读数。Spearman和Pearson相关性分析结果显示这两者都具有强相关性，这说明这个系统无论是在经过转导的细胞中还是筛选后的细胞中都可以有效保持sgRNA的代表性。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图4 使用6-硫鸟嘌呤（6-TG，一种核苷酸类似物癌症治疗药物）作为筛选标记进行sgRNA文库筛选的操作流程示意图。sgRNA文库转导Cas9+ A375细胞后，进行潮霉素筛选、细胞扩培，之后将Cas9+/sgRNA+细胞传代至两个培养皿中。在其中一皿Cas9+/sgRNA+细胞培养液中添加6-TG，另外一皿细胞不添加6-TG使用常规培养条件进行培养。细胞扩培之后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit提取基因组DNA并制备测序样品。
 
CRISPR全基因组sgRNA文库系统
图5 从6-thioguanine (6-TG)筛选出的细胞中分离提取sgRNAs进行鉴定分析。Panel A. 比较用于制备慢病毒的原始质粒文库和转导后未经筛选/筛选后细胞中的sgRNA代表性。作用于HPRT（红点）和NUDF5的4条sgRNAs（黑点）均富集在6-TG筛选过的细胞中。在质粒文库（灰色）和转导后未经筛选的细胞（橘色）中，这些sgRNAs的表征也是可以检测到的。Panel B. 在经过6-TG筛选后的细胞中，sgRNA的代表性就发生了转变（蓝色）。在这个相关性分析中，重点标注出了被富集的单个sgRNAs（红点和橘点）。插图显示了与未经筛选的细胞相比，在筛选后的细胞中作用于HPRT的4条sgRNAs的富集倍数。
 
■ 产品组份
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System（Code No. 632646）
Guide-it Cas9 Lentiviral Transfection Mix 5 vial
Guide-it Lentiviral sgRNA Library Transfection Mix 5 vial × 2
pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg Vector (0.5 μg/μl) 10 μl
Lenti-X 293T Cell Line 1 ml
Lenti-X GoStix Plus  
· Chase Buffer 3 ml
· Lenti-X GoStix Plus 3 testes
· p24 Control 5 testes
   
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651）
LVXS P5 primer pool with index 1 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 2 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 3 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 4 (10 μM) 100 μl
LVXS P7 primer with index 5 (10 μM) 100 μl
TaKaRa Ex Taq （5 U/μl) 30 μl
10X Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) 500 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 400 μl
   
Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit（Code No. 632647）
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651）
NucleoBond CB 500（Code No. 740509）
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10）
 
 
产品详情请点击：CRISPR全基因组sgRNA文库系统
 

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 货 号 #E3322S-NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes                              收藏

货 号
规 格
价 格(元)
北京库存
上海库存
广州库存
成都库存
苏州库存

#E3322S
20 rxns
5,139.00
有
无
有
无
有

#E3322V
10 rxns
2,699.00
无
无
无
无
无

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特性：

一个小时甚至更短时间内快速合成微克级的 sgRNA
EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 货 号 #E3322S
 

概述

EnGen™ sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes 能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列，单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。
自然界中，S. pyogenes Cas9 的启动与 2 种 RNA 有关。及 crRNA 和 trRNA。crRNA 又称CRISPR RNA，包含大约 20 个核苷酸，位于PAM （Protospacer Adjacent Motif)  NGG 序列的上游，与目标 DNA 反义链同源互补。另一种是 tracrRNA  又称  transactivating crRNA， tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中，将 tracrRNA  和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链指导 RNA ( sgRNA)  , 并与 Cas 9 形成复合体，识别并切割目标 DNA。
在 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中，含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由 DNA  聚合酶进行填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒可在一个反应中完成 dsDNA 的合成及 RNA 转录，生成具有功能的 sgRNA。
 

实验流程：

 EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 货 号 #E3322S

A．特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域（反应混合液中提供）。室温下，混合特异性目标链（或 EnGen sgRNA 调控序列）与 EnGen2X sgRNA 反应预混液（NTPs，dNTPs，S. pyogenes Cas9 识别支架序列）及 EnGen sgRNA 酶预混液（DNA 和 RNA 聚合酶）。B．在 37℃ 条件下，具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸，形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的 dsDNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下，单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。

EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 组分

– EnGen sgRNA 酶混合液
– EnGen 2X sgRNA 反应混合液，S. pyogenes
– DNase I （RNase-free）
– EnGen sgRNA control Oligo，S. pyogenes

参考文献

关于该酶特性和产品应用的参考文献，请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com 查询。