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注意：购买632646产品时，需要填写专利确认书
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| CRISPR全基因组sgRNA文库系统 |
· 包含超过76,000条基于Brunello文库的sgRNAs，既可以实现更高的靶向特异性和靶向活性，
同时也可以保持很低的脱靶效应点击下载sgRNA representation data.
· 每一个人类基因对应4条高活性sgRNAs, 可以通过单一模块进行筛选
· 优化后的sgRNA scaffold有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用，实现高基因编辑效率
· 慢病毒sgRNA文库已与Lenti-X Packaging Single Shots和Xfect Transfection Reagent
配制在一起，因此只需要加入水就可以获得高效转染混合液，用于转染Lenti-X 293T cells
制备高滴度慢病毒sgRNA文库
· 自失活慢病毒载体保证慢病毒制备和使用过程中高水平的生物安全性 |
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| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System可以使用CRISPR/Cas9在人细胞中轻松实现全基因组表型敲除筛选。Lenti-X Single Shots包含了全基因组sgRNA文库和Cas9表达系统，可方便制备出稳定表达Cas9和sgRNA文库的细胞系进行每一次筛选。该sgRNA文库是基于Brunello文库 (Doench et al. 2016; Doench, 2018) 所构建的，包含了超过76,000条向导RNA以及非靶向sgRNA对照，每一个人类基因对应4条高效率sgRNAs，可对大约19,000个基因进行有效筛选。文库筛选后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit制备NGS样品进行新一代测序分析，此试剂盒包含了以sgRNA文库转导后的细胞来制备NGS样品所必需的引物和试剂。 |
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| 我们精心构建这个sgRNA文库以确保其固有的sgRNA代表性。在文库合成、扩增、病毒制备和靶细胞转导每一步操作过程中，我们都会对sgRNA代表性进行检测。Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含经过验证的构建在慢病毒载体上的sgRNA文库和Lenti-X 293T cells，这个sgRNA文库以脱水形式提供。只需要添加水至冻干的文库混合物中就可以获得高效转染混合液，然后将混合物添加至293T细胞的培养液中进行转染就可以制备获得慢病毒粒子。每一批sgRNA文库都通过NGS进行了检测，确保超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。我们也优化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中的sgRNA scaffold序列，有助于加强Cas9-sgRNA之间的相互作用，实现高基因编辑效率。本系统通过使用高滴度的慢病毒包装系统Lenti-X Packaging Single Shots，可以有效维持慢病毒sgRNA文库的代表性。 |
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| 应用： |
· 人细胞全基因组表型筛选
· 功能缺失型遗传筛选
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| 注意事项： |
· Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit (Code No. 632651) 包含了扩增sgRNA进行
NGS分析的所有引物和试剂，起始样品为从筛选出的细胞群分离提取的基因组DNA，
此试剂盒可用于制备10个测序文库（20 PCRs）。
· Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit (Code No. 632647)包含
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit和基因组DNA纯化试剂以及PCR产物纯化试剂。 |
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| 参考文献： |
Doench, J.G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nat. Rev. Genet.19, 67 80 (2018).
Doench, J.G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184 191 (2016). |
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| Technical Notes |
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Performing a phenotypic screen using the Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System |
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| CRISPR screening webinar |
| Lentiviral CRISPR/Cas9 knockout screening made simple |
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| 实验例： |
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图1 Guide-it CRISPR sgRNA文库所使用的载体和sgRNA scaffold示意图。Panel A. 从pLVXS-EF1a-Cas9-PGK-Puro和pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg 载体图谱中我们可以观察到所使用的慢病毒载体骨架。这些慢病毒载体经过了自失活处理，以提高病毒制备和使用过程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体包含一个IRES连接的双顺反子表达框，可以同时表达mCherry红色荧光标记和潮霉素抗性筛选标记。sgRNAs由人U6启动子表达，包含经过优化的scaffold序列，可以高效招募Cas9，实现更高的基因编辑效率(Panel B)。
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图2 通过mCherry红色荧光判断慢病毒sgRNA文库的转导效率。按照用户手册的指导来制备慢病毒sgRNA文库，转染48小时后收集慢病毒粒子，以不同的MOIs转导表达Cas9的A375细胞。接种培养转导后的细胞，转导48小时后通过荧光显微镜和FACS 检测转导效率。
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图3 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含的sgRNA代表性分析。Panel A. 质粒文库中的sgRNA代表性分析。将基于Brunello的sgRNA文库克隆至pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体并进行扩增，通过NGS验证这个质粒文库中的sgRNAs代表性。检测结果显示，这个文库中超过90%的sgRNAs在10倍分布范围以内。图表中的柱形表示具有特定读段数的sgRNA数量。Panel B. 比较质粒文库和转导细胞中的sgRNA代表性。以潮霉素为筛选标记，筛选出Cas9+/sgRNA+ A375细胞，提取基因组DNA并进行PCR扩增。测序分析PCR产物，检测PCR产物中每一个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA文库的读数。Spearman和Pearson相关性分析结果显示这两者都具有强相关性，这说明这个系统无论是在经过转导的细胞中还是筛选后的细胞中都可以有效保持sgRNA的代表性。
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图4 使用6-硫鸟嘌呤（6-TG，一种核苷酸类似物癌症治疗药物）作为筛选标记进行sgRNA文库筛选的操作流程示意图。sgRNA文库转导Cas9+ A375细胞后，进行潮霉素筛选、细胞扩培，之后将Cas9+/sgRNA+细胞传代至两个培养皿中。在其中一皿Cas9+/sgRNA+细胞培养液中添加6-TG，另外一皿细胞不添加6-TG使用常规培养条件进行培养。细胞扩培之后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit提取基因组DNA并制备测序样品。
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图5 从6-thioguanine (6-TG)筛选出的细胞中分离提取sgRNAs进行鉴定分析。Panel A. 比较用于制备慢病毒的原始质粒文库和转导后未经筛选/筛选后细胞中的sgRNA代表性。作用于HPRT（红点）和NUDF5的4条sgRNAs（黑点）均富集在6-TG筛选过的细胞中。在质粒文库（灰色）和转导后未经筛选的细胞（橘色）中，这些sgRNAs的表征也是可以检测到的。Panel B. 在经过6-TG筛选后的细胞中，sgRNA的代表性就发生了转变（蓝色）。在这个相关性分析中，重点标注出了被富集的单个sgRNAs（红点和橘点）。插图显示了与未经筛选的细胞相比，在筛选后的细胞中作用于HPRT的4条sgRNAs的富集倍数。
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| ■ 产品组份 |
| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System（Code No. 632646） |
| Guide-it Cas9 Lentiviral Transfection Mix |
5 vial |
| Guide-it Lentiviral sgRNA Library Transfection Mix |
5 vial × 2 |
| pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg Vector (0.5 μg/μl) |
10 μl |
| Lenti-X 293T Cell Line |
1 ml |
| Lenti-X GoStix Plus |
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| · Chase Buffer |
3 ml |
| · Lenti-X GoStix Plus |
3 testes |
| · p24 Control |
5 testes |
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| Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651） |
| LVXS P5 primer pool with index 1 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 2 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 3 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 4 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 5 (10 μM) |
100 μl |
| TaKaRa Ex Taq （5 U/μl) |
30 μl |
| 10X Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) |
500 μl |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) |
400 μl |
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| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit（Code No. 632647） |
| Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651） |
| NucleoBond CB 500（Code No. 740509） |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10） |
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