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特性：

 一个小时甚至更短时间内快速合成微克级的 sgRNA

 

概述

EnGen^™ sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes 能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列，单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。

自然界中，S. pyogenes Cas9 的启动与 2 种 RNA 有关。及 crRNA 和 trRNA。crRNA 又称CRISPR RNA，包含大约 20 个核苷酸，位于PAM （Protospacer Adjacent Motif)  NGG 序列的上游，与目标 DNA 反义链同源互补。另一种是 tracrRNA  又称  transactivating crRNA， tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中，将 tracrRNA  和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链指导 RNA ( sgRNA)  , 并与 Cas 9 形成复合体，识别并切割目标 DNA。

在 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中，含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由 DNA  聚合酶进行填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒可在一个反应中完成 dsDNA 的合成及 RNA 转录，生成具有功能的 sgRNA。

 

实验流程：

 

A．特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域（反应混合液中提供）。室温下，混合特异性目标链（或 EnGen sgRNA 调控序列）与 EnGen2X sgRNA 反应预混液（NTPs，dNTPs，S. pyogenes Cas9 识别支架序列）及 EnGen sgRNA 酶预混液（DNA 和 RNA 聚合酶）。B．在 37℃ 条件下，具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸，形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的 dsDNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下，单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。

EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 组分

– EnGen sgRNA 酶混合液

– EnGen 2X sgRNA 反应混合液，S. pyogenes

– DNase I （RNase-free）

– EnGen sgRNA control Oligo，S. pyogenes

参考文献

关于该酶特性和产品应用的参考文献，请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com 查询。