日度归档：2024年9月18日

蛋白保存方法详解-技术文章

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蛋白保存方法详解

  生物大分子的贮藏保存可分为干态和液态贮藏两种。蛋白质失活受多种理化因素的影响，主要有空气、温度、水分、光线、酸碱度、样品状态、微生物活动、保存时间和容器等。这些因素可单独起作用，但更多情况是协同作用。总的来说，蛋白质的保存主要考虑其构型稳定、活性中心的保护、避免辅助因子丧失等，以防止其变性、解聚或降解。由于温度和水分对蛋白质的稳定性影响很大，故蛋白质最好是低温、冷冻或冷冻干燥后低温干燥保存。

1. 液态保存

  （1）．在低温下保存 蛋白质对热敏感，温度越高，稳定性越差。因此，低温保存蛋白质溶液在绝大多数情况下是有利的。一般蛋白质越纯，其稳定性越差。特别是纯酶溶液，对热很不稳定(少数酶例外，如核糖酸酶能短期煮沸，胰蛋白酶能在稀HCl中耐90℃，及某些高温细菌产生的耐热性酶等)，多数在35℃一40℃以上就会失活，难以长期保存，在普通冰箱中通常也只能保存一周左右。因此，液态蛋白质样品常常在—5℃～—10℃以至—20℃以下冰冻保存比较理想，有时经数月或数年仍保留大部分活性。

  但是，各种蛋白质的耐热性不同，并非温度越低．稳定性越好。羧肽酶、脂蛋白和某些抗体经冰冻再融解，即完全变性破坏。但某些酶经冻融后，活性反而增加，这可能是由于酶颗粒结构松散，表面积增大，暴露出更多活性基团的缘故。反复冰冻和融化一船会导致蛋白质变性．应尽量避免。为了防止冻融损伤，冰冻保存要求样品浓度大、体积小、表面积大、含盐低、冻结迅速、—70℃以下保存、用时迅速融化等。

   (2)．在稳定PH下保存 多数蛋白质只有在很狭窄的pH范围内才稳定．超出此范围即迅速变性。如鲸肌红蛋白在等电点PH6.8附近时稳定，卵类粘蛋白在中、酸性条件下对热 稳定。蛋白质稳定存在的PH一般是等电点。因此，酸性、中性和碱性蛋白酶酌稳定pH分别为PH2～PH6、PH6～PH9和PH5～PH10.5。但也有例外，如血浆蛋白质的等电点PH4.6，而其稳定pH为6.8，稳定PH与其等电点并不相同。酶的最稳定PH也并非是酶反应的最适PH，二者有时可相差l至数个pH单位。所以保存液态蛋白质样品时，应小心调到其稳定PH范围内。

  (3)．在高浓度下保存 液态蛋白质易受水化作用影响，保存时浓度不能太稀(如1毫克／毫升以下)，否则将可能引起亚基解离、表面变性或器壁吸咐。一般蛋白质在浓溶液中比较稳定，中间样品的保存可采用湿法沉淀。需要保存酶溶液时，其蛋白质浓度也应大于1％。保存时间较长时，还需加入防腐剂、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)或其它稳定剂。如免疫球蛋白可加 0.04％叠氮钠，-20℃下冻存。蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的选择：中性蛋白酶常用EDTA，碱性蛋白酶用二异丙基氟磷酸(DFP)、苯甲基璜酰氟(PMSF)，酸性蛋白酶用十二烷基磺酸钠（SDS）、N —溴琥珀酰亚胺。活性中心为丝氨酸的蛋白面加二异丙基氟磷酸，活性中心为巯基的蛋白酶加对氯汞苯甲酸等。但某些抑制剂(如DFP、PMSF)不仅抑制蛋白酶，对其它酶可能也有抑制作用，使用时应慎重。

  (4)．在保护剂存在下保存 很早就有人观察到，在无菌条件下，室温保存了四十五年的血液，血红蛋白仅有少量改变，许多酶仍保留部分活性。另一方面，有些纯酶浓即使冷却也很不稳定，保存期仅为几小时或几天。上述两种现象的原因是血液中含有某些使蛋白质稳定的因家，而纯酶则缺乏这些稳定因素。为了较长期保存蛋白质溶液(特别是敏感的纯酶 或稀蛋白溶液)，常常加入某些稳定剂进行保护。多数蛋白质只有在疏水环境才能长期保存。加入某些物质可以降低溶液的极性，避免蛋白质变性失活。一些蛋白质在高离子强度(1mol/L~4mol/L或饱和盐液)的极性环境下保持活性，中性盐可稳定这类蛋白质。 一些蛋白质表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓慢氧化为次磺酸或二硫化物，使蛋白质因电荷或(和)形状发生改变而失活。保存时可加人巯基试剂，使蛋白质处于还原状态，并隔绝空气（甚至真空或惰气中）密闭保存。

  2.固态保存

  （1）．制成干粉或结晶 固态蛋白质比液态稳定。一般蛋白质含水量超过10％时，无论在室温或低温均容易失活；含水量若降低至5％时．在室温或冰箱中均比较稳定，但在37℃活性则明显下降。低含水量对微生物和化学活性不利，一般认为，微生物活性在含水量10％以下、化学活性在3％以下即被抑制。长期保存蛋白质的最好办法是把它们制成结晶或干粉（现多采用冷冻干燥）。

  （2）．制成水不溶酶 在多数情况下，酶经固定化后，对酸、碱、蛋白酶、温度等稳定性提高，更易于保存。

  （3）．制成酶衍生物 这也能提高某些酶的稳定性。 总的来说，蛋白质的保存主要考虑其构型稳定、活性中心的保护、避免辅助因子丧失等，以防止其变性、解聚或降解。由于温度和水分对蛋白质的稳定性影响很大，故蛋白质最好是低温、冷冻或冷冻干燥后低温干燥保存。

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E. coli MV1184 Competent Cells酶试剂盒Takara Clontech

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E. coli MV1184 Competent Cells
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Takara 9055 E. coli MV1184 Competent Cells 100 μl × 10 ￥530 E. coli MV1184 Competent Cells E. coli MV1184 Competent Cells E. coli MV1184 Competent Cells
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■ 制品内容E. coli MV1184 Competent Cells
E. coli MV1184 Competent Cells 100 μl × 10
pUC119 plasmid (0.1 ng/μl) 10 μl
SOC Medium* 1 ml × 10
*SOC Medium      2%   tryptone
 0.5%   yeast extract
 10 mM   NaCl
 2.5 mM   KCl
10 mM   MgSO4
10 mM   MgCl2
 20 mM   Glucose
 
■ 制品说明
Takara公司在Hanahan’s method基础上进行了改良，制备出E.coli MV1184 Competent Cells，当1 ng pUC119转化100 μl 细胞时，转化效率可达1×107 cfu/μg。
E.coli MV1184宿主具有琥珀突变抑制因子，只允许没有发生琥珀突变的载体进行复制，可以用作琥珀突变DNA的选择宿主。同时本宿主含有F’质粒，也可作为M13 phage载体DNA的宿主菌，制备单链DNA。此外，本宿主在使用pUC系列质粒载体或M13 phage载体进行转化或转染时，具有α-互补性，可以通过在培养基中加入X-Gal 和 IPTG进行蓝白筛选。
X-Gal : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
 
■ 细胞浓度
1-2×109 bacteria/ml
 
■ Genotype
E. coli MV1184：ara,△(lac-proAB),rpsL, thi (Φ80lacZ△M15), △(srl-recA) 306::Tn10 (tet r) / F’ [traD36, proAB+, lac Iq, lacZ△M15]
 
■ 保存
-80℃。
注意： 如果不在-80℃下保存，转化效率将会降低。此时，在使用前，请使用附带的pUC119 对照质粒来确认细胞的转化效率。不能液氮保存。
 
■ 转化效率
按照“质粒载体转化”的使用方法，使用1 ng 的pUC119转化到100 μl E. coli MV1184 Competent Cells中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选，转化效率 : >1 x 107 cfu/μg pUC119
 
 

2-(2-Furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide-富士胶片和光纯药Wako

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