RNA的提取方法大总结

这篇文章主要讲的是几种常用的RNA提取方法。

1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法

原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA.

本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞（如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。

2、盐酸胍-有机溶剂法

本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。

3、氯化锂-尿素法

本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo（dT）提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。

4、热酚法

本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。

5、快速提取法

本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。

6、细胞质RNA提取法

本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500?g/107个细胞。

7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA

本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。

8、一步快速热酚抽提法

基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便，并突出体现以下几个优点：1）将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RNA的提取产量；2）RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RNA提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA（<5.8S）的丢失，而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

什么是预染蛋白marker，关于预染蛋白marker你知道多少？

         蛋白marker可分为未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准以及预染的Marker即单色预染和多色预染。那么，什么是预染蛋白marker？预染蛋白marker为一些纯化好的蛋白的混合物.这些蛋白混合物与一种蓝色染料共价偶联.可在凝胶电泳时出现强度均匀的8条带.同未预染的蛋白marker相比,预染蛋白marker因与染料共价偶联而在SDS-PAGE电泳时的迁移特性发生某些改变.
        预染蛋白分子量标准
        预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染蛋白Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果;如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳;另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。
        预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。如果沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些!单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。
        非预染蛋白marker和预染蛋白marker有什么区别
        简单讲，就是非预染蛋白marker电泳时看不到条带，染色后才能看到，而预染蛋白marker会有特定的某些蛋白条带带有颜色，电泳过程中可以观察到，还有在WB过程中也起到转膜是否成功的指示作用
        预染的marker的分子量在不同浓度胶上跑出来是不一样的，这个叫表观分子量。未预染的marker是最准确的，如果只做wb，预染的marker就够了，每次都能观察转膜情况。
        其他都是些细节上的区别，比如有些预染蛋白marker会做成彩虹色的，以便区别分子量大小有些预染蛋白marker的条带比较多等等

抗荧光衰减封片剂使用说明及注意事项

 抗荧光衰减封片剂是一种用于减缓荧光淬灭的封片试剂。以甘油为基础,加入抗荧光淬灭剂,有强烈的防荧光衰减作用,用于对荧光组织和细胞样品的封片。上海金畔生物科技有限公司供应多种规格抗荧光衰减封片剂，现货发售。下面介绍一下索拉表抗荧光衰减封片剂的使用说明和注意事项。

使用说明： 

1． 贴壁细胞样品： A. 染色完毕后，吸尽液体。 B. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。 C. 随后就可在荧光显微镜下观察样品了。 

2. 组织切片： A. 染色完毕后，吸尽液体。 B. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。 C. 随后就可在荧光显微镜下观察样品了。 

3. 其它样品： 其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。 

注意事项： 

1. 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。 

2. 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭和衰减，但无法避免，请尽量避光和及时观察。 

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 

4.此产品不象树胶一样能固定盖玻片。所以封片后，如果方面，可以在四周封一丝中性树胶类物质以固定盖玻片。

此外，上海金畔生物科技有限公司还提供完善的售后技术支持。如果您在使用抗荧光衰减封片剂过程中遇到任何技术问题可以拨打上海金畔生物科技有限公司技术支持电话4009686088。上海金畔生物科技有限公司技术工程师将为您提供技术服务。

上海金畔生物科技有限公司印度墨水使用方法

 印度墨水使用方法:

2.取样品333克按MPN三管法分别取100克、10克和1克分装在各三个2000ml、250ml和100ml的三角瓶中，在三角瓶中已装有经45℃预热的9/10 (样品为1/10)的无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水，摇匀，在36℃培养18h±2h。

3. 各取10ml上述悬浮液加到装有90mlEE肉汤(022160)/mLST-Vm(022212)的150mL的三角瓶中，在36℃/44℃增菌培养18-22小时。

4. 用划线或涂布法把混匀的肉汤接种到阪崎肠杆菌显色琼脂平板上，35-37℃培养18-24小时。

5. 可使用MicrogenTMGN-ID或API20E或生化管试验，对疑似阪崎肠杆菌菌落进行生化鉴定。

PDA培养基的制备方法

PDA培养基又称马铃薯葡萄糖琼脂，PDA培养基一种常用的培养基，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。属于固体培养基、半合成培养基。以下是关于PDA培养基的制备方法。

PDA培养基的制备：

(1)称量和熬煮 按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。

(2)加热溶解 把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

(3)分装 按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

(4)加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

(5)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

PDA培养基的制备需要注意以下几点：

1.培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

2.PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

3.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。

4.培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.2g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性。

以上便是关于PDA培养基的制备的方法及注意事项。