线粒体的提取方法简单介绍-技术文章

线粒体的提取方法简单介绍

提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案:

心肌组织切碎后在4 ℃介质(0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl  pH7.4,0-4℃)中制备心肌组织匀浆。匀浆经750g、离心10 min后留上清,以9000 g离心20 min  后留沉淀,重新悬浮后以9000 g再离心20 min,弃上清得线粒体.全部操作于4 ℃进行。

培养细胞提取线粒体.细胞弃去培养液后,用细胞收集液作用2到3 min,用scraper,将细胞收集起来,6000 g离心15 min。弃上清,之后加细胞匀浆液,用匀浆器或手动匀浆管匀浆,将装有匀浆液的离心管配平后放入普通离心机,以2500 rpm,离心15 min,缓缓取上清液,移入高速离心管中,保存于有冰块的烧杯中.以17000 rpm离心20  min,弃上清,留取沉淀物。加入0.25mol/L蔗糖与0.003 mol/L氯化钙液l ml,用吸管吹打成悬液,以17000 rpm离心20  min,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液.即得线粒体。

简单的鉴定人线粒体的方法:

1、形态法辨别取

你用试剂盒提取最后一步的上清液和沉淀物悬液,分别滴一滴于干净载玻片上,标记涂片,各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。油镜下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

2、PCR法

抽提你提取的线粒体DNA。人线粒体基因由16569个碱基对组成。基因组含有37个基因,其中13个为蛋白质基因。2个为rRNA基因,还有22个tNRA基因。可以选择扩增其中编码电子传递链酶复合体中的亚基基因进行辨别。

3、利用单抗进行标记检测

线粒体外膜的标记酶为单胺氧化酶,用单胺氧化酶单克隆抗体进行反应后上流式细胞仪进行检测。

4、电镜下观察(有条件的话上电镜进行观察恐怕是最直接的了)

线粒体提取试剂盒的操作步骤:

1. 样本处理  

a. 组织匀浆:称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等,PBS或生理盐水冲洗,洗净血水,滤纸吸干,用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer,0℃冰浴上下研磨组织20次;

b. 培养细胞匀浆:消化细胞,PBS洗涤,800g离心5~10 min收集细胞,计数。每次提取需要5×107个细胞,加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内,0℃冰浴研磨30~40次。

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管,4℃,1000g 离心5 min。

3.取上清,转移至新的离心管中,4℃,1000g再次离心5 min。

4.取上清,转移至新的离心管中,4℃, 12,000 g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。

5.往线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀,4℃,1000 g 离心5 min。

6.取上清,转移至新的离心管中,4℃, 12,000 g 离心10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底。

7.用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀,立即使用或-70℃保存。

上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商,生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养基、试剂盒、实验耗材等产品。线粒体提取试剂盒为上海金畔生物科技有限公司自产产品,其货号为SM0020。线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高,可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

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