培养皿的使用及分类

培养皿一般用玻璃或塑料制成，是培养微生物或细胞培养的常用实验耗材，通常玻璃的可以用于植物材料、微生物培养和动物细胞的贴壁培养也可能用到。塑料的可能是聚乙烯材料的，适合实验室接种、划线、分离细菌的操作，可以用于植物材料的培养。培养皿易碎，在清洗和使用时要小心轻拿轻放，使用完后要及时清洗干净，存放在安全、固定的位置。

培养皿的清洁

1.浸泡：新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗：将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3.浸酸：浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。

4.冲洗：刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

培养皿的分类

1.根据培养皿用途的不同可分为细胞培养皿和细菌培养皿。

2.根据制造材料的不同分为塑料培养皿和玻璃培养皿，但进口培养皿和一次性培养皿大都是塑料材料。

3.根据大小的不同通常可分为直径为35mm，60mm，90mm。150mm培养皿。

4.根据分隔的不同又可分为2分隔培养皿，3分隔培养皿等。

5.培养皿材质基本上分为两类，主要为塑料和玻璃的，玻璃的可以用于植物材料、微生物培养和动物细胞的贴壁培养也可能用到。塑料的可能是聚乙烯材料的，有一次性的和多次使用的，适合实验室接种、划线、分离细菌的操作，可以用于植物材料的培养。

平版培养时培养皿要倒置

1.操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌,倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上。

2.培养过程中,细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物,释放热量及有水排出,如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中,影响菌落的生长。

3.如果培养目标是收集细菌代谢物,而且代谢物易溶于水,倒着培养可能会方便收集。培养时培养皿中会产生较多的水蒸气，水蒸气在皿盖上凝结会产生水滴，如果培养皿正置，水滴滴下会将菌落冲散，这样的话一个大菌落可能会分散开成为很多小菌落，对细菌的培养和计数都造成很大的麻烦。如果导致的话，培养基在上，皿盖在下，水滴滴下不会滴到菌落上。

培养皿使用注意事宜

1.使用前经过清洁消毒，培养皿清洁与否对工作影响较大，可影响培养基的酸碱度，若有某些化学药品的存在，会抑制细菌生长。

2.新购的培养皿应先用热水冲洗，再置于质量分数为1%或2%的盐酸溶液中浸泡数小时，使游离碱性物质除去，再用蒸馏水冲洗2次。

3.若要培养细菌，再用高压蒸气(一般6.8*10的5次方Pa高压蒸气)，120℃的温度下30min灭菌，置室温中干燥，或用干热灭菌，就是将培养皿置于烘箱内，温度控制在120℃左右的情况下维持2h，即可杀死细菌的胞牙。

4.经过消毒的培养皿才能接种培养使用。

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微生物培养基的配制方法以及常见培养基的成分

    微生物培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。微生物培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。下面我们来介绍一下基本微生物培养基的配制方法。

微生物培养基的配制

    溶化：

    一般应放在玻璃器皿或搪瓷齐内.加入蒸馏水,隔水加热以促其溶解,加热时应经常搅拌,防止焦结,待其溶解后补足水分.

    在使用干燥培养基时,先将蒸馏水按定量加入容器中,然后称取一定量培养基干粉放入水中,静置10—15min,搅拌,振荡,或延长时间以促进溶解,一般不要热,必要时加热,但时间不宜过长,温度不宜过高,避免某些营养成分被破坏.

    校正酸碱度（调节pH）：

    培养基必须有适当的pH.因此测定pH是培养基配制过程中的重要步骤之一,测定pH的标准温度为25士2℃.调节pH可用无菌的1mol/l氢氧化钠溶液或10%碳酸钠溶液、1mol/l盐酸溶液.当调节缓冲液的pH时,宜用6mol/l磷酸或10mol/l氢氧化钾溶液.灭菌后的pH会比灭菌前的pH升高或降低,一般高压灭菌前培养基的pH会比最终pH调高0.2左右,灭菌后基本合适.因此对培养基、缓冲液、试剂在灭菌前后的pH均进行测定,并记下每次pH的测定结果,有助于积累数据考察每种培养基、缓冲液、试剂对灭菌程序的耐受性,从而指导灭菌前pH的调节.干燥培养基一般已校正过pH,用时也必须再验证.测定时,一般用指示剂滴入培养基观察其颜色的变化,或用pH计校正,如与所需pH不符,可用以上的酸或碱液加以校正.调整pH后要加热过滤,使培养基澄清.

    培养基的灭菌：

    培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌,各种培养基的灭菌时间和压力,按其成分不同而定.普通培养基采用121℃、103.42kPa灭菌15min,但容器和装量较大时,应延长至20min.含糖培养基115℃、68.85kPa灭菌30min.含糖、血清、鸡蛋等培养基可用流动蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min,连续3d,间歇灭菌.血清或组织液,采用低热56—58水浴1h,连续5—6d灭菌,一些遇高温即被破坏的物质如尿素、腹水等,可用细菌过滤器,过滤除菌.高压灭菌应严格按照操作规程执行,必须逐渐加热,彻底排除灭菌器内的空气,再逐渐升压保持预定的压力和时间,达到全部杀灭微生物.以上的灭菌时间和温度要经过验证确认,如不同类型培养基混合一起灭菌时宜采用115℃、68.85kPa灭菌30min为好。

    常见培养基的成分

    1 ．营养肉汤

    成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

    制法：按上述成分混合，溶解后校正pH，121℃高压灭菌15min。

    2．营养琼脂培养基

    成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

    制法：将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121℃，15min高压灭菌备用。

    3．MRS培养基

    成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4??2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g，（琼脂15~20g），蒸馏水1000mL。

    制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.2~6.4，分装于三角瓶中，121℃,灭菌15min。

    4．脱脂乳培养基

    成分：牛奶，蒸馏水。

    制法：将适量的牛奶加热煮沸20~30min，过夜冷却，脂肪即可上浮。除去上层乳脂即得脱脂乳。将脱脂乳盛在试管及三角瓶中，封口后置于灭菌锅中在108℃条件下蒸汽灭菌10~15min，即得脱脂乳培养基。

    5．培养基A

    成分：蛋白胨10.0g，酵母提取物1.0g，葡萄糖10.0g，NaCL5.0g，琼脂15.0g，水1000mL。制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至7.0~7.2，分装于三角瓶中，121℃，灭菌15min。

    6．PTYG培养基

    成分：胰胨Tryptone（Oxoid）5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉（Oxoid）10g，葡萄糖10g，吐温80 0 1mL，琼脂15~20g，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，盐溶液4mL。

    制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.8~7.0，分装于三角瓶中，115℃灭菌30min。

    盐溶液制备：无水氯化钙0.2g，K2HPO4??1.0g，KH2PO4??1.0g，MgSO4 。7H2O 0.48g，NaCO3 10g，NaCL 2g，蒸馏水1000mL，溶解后备用。

多聚-L-赖氨酸(Poly-L-Lysine)的原理、应用及配置

多聚赖氨酸一般常见的分子量有70，000~150，000，150，000~300，000和>300，000，分子量越大，黏附力越强，但相对完全溶解较困难。

原理：

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。培养瓶表面的性质对于细胞培养至关重要，细胞表面的糖蛋白（阴性）易于吸附在亲水性的表面上，因而细胞培养表面如果有相当含量的阳性电荷更能促进细胞吸附，这正是运用多聚赖氨酸优化细胞培养表面的重要所在。

应用：

适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

溶液配制：

用去离子水溶解，配制成母液备用。保存于-20℃。

玻片处理：

1.灭菌水稀释聚赖氨酸溶液，一般的使用浓度为0.01％。

2.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。

3.在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

注意：

1.每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。

2.用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

3.释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

4.用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃

5.多聚赖氨酸浓度可以高一些，吸出来的可以重复利用至少20次。

培养瓶处理：

1.包被培养板或者是培养瓶，一般多聚赖氨酸浓度为0.01％，

2.准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。

3.0.01%的多聚赖氨酸以50微升每平方厘米的量均匀涂于培养底物的表面，室温下静置5min，吸除多余液体。

4.加入灭菌水，反复冲洗三次，无菌操作。

5.处理后无菌晾干备用。

6.回收后保持无菌的多聚赖氨酸可反复利用。

微生物培养基的灭菌方法有哪些

      微生物培养基是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和版合成培养基三类。按照微生物的种类分 培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。培养基应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。为了达到特定要求的研究，需要进行培养基配制和灭菌。那么微生物培养基的灭菌方法有哪些呢？

      微生物培养基的灭菌方法

      灭菌的方法，通常可以分为加热灭菌（包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒）、过滤去菌、射线灭菌和消毒、化学药剂灭菌和消毒四大类。下面具体讲解微生物培养基的灭菌方法。

      1. 干热灭菌法（即热空气灭菌法）

      干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电热烘箱中。

      打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内空气的温度达到160℃~170℃，关闭通气孔使箱内的温度保持在160℃左右并维持1.5-2h。时间一到，切断电源。待温度下降60℃~70℃以下，方可打开箱门取灭菌物品，否则骤冷后易使箱内玻璃仪器破损。

      2. 加压蒸气灭菌法

      利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高，来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。

      在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易干凝固。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。

      手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：

      （1）在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。

      （2）接通电源，进行加热。

      （3）当压力到达5bl/in2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。

      （4）当压力表＊的压力到达15bl/in2（即 1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度达到121℃，维持30min不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。

      （5）灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。

      3. 间歇灭菌法

      常采用阿诺（Arnold）氏灭菌器和柯赫（Koch）氏灭菌器或蒸笼灭菌，常压条件下蒸汽温度不超过100℃。在没有高压灭菌器设备的情况下或不宜加压灭菌的物品，可采用此法灭菌。

方法是：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，每d蒸煮1次，每次煮沸lh，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死的残留芽孢萌发成营养体，以便下1次蒸煮时杀灭。

      4. 过滤除菌法

      一些不能加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），可以用过滤除菌法，一般用细菌过滤器进行除菌。

      细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板孔眼很小，细菌不能通过。因此，过滤后的液体就除去了细菌。在进行过滤除菌前，整个细菌过滤器和接受液体的器皿，必须要包装妥当并进行加压蒸汽灭菌后方可使用。

      下面介绍石棉板滤器的构造及其操作方法。石棉板滤器又称蔡氏（Scitz）滤器，它是由石棉制成的圆形滤板和一个特制漏斗组成。此漏斗分上下两节。上节为圆形金属筒，下节为金属漏斗。两节由三个活动螺旋固定，便于装卸。使用时拆开两节，将滤板放在漏斗上的金属筛板，再加上上节，然后将螺旋扭紧，将欲滤溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张无菌的新滤板。石棉板滤器因容积大小不同而有各种型号，石棉板也有不同规格型号使用时必须根据需要搭配妥当。

      5. 紫外线灭菌

      波长260~280nm之间的紫外线有很强的杀菌能力，一般紫外灯管能产生253.7nm的紫外光，杀死力强而稳定，但穿透力弱一般只适宜物体表面、空气灭菌。例如接种室、培养室、手术室、药厂包装室等空气灭菌。一般30w灯管、9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时，先喷洒石碳酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。

      在进行微生物接种和分离等操作时，常须用紫外线来杀灭接种室（箱）空气、台面等处的微生物。

      紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力较弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。

      紫外线对眼粘膜及视神经有强烈的损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直接在紫外线灯开启下工作和用眼睛直视开启的紫外灯。

      6. 化学药剂消毒灭菌

      微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂，

      以上就是微生物培养基的灭菌方法说明，如果你的培养基中所有的成分都可以耐高温，那就用压力蒸汽高温灭菌的方式。如果你的培养基中有些成分不耐高温，就可以用除菌过滤的方式除菌：用除菌滤器过滤培养基至已灭菌的培养器中。如何要求不高，部分试验用培养基，可以用煮沸的方式灭菌。

石炭酸复红染色液的用途

 石炭酸复红染色液又称苯酚品红染色液。生物学上常用石炭酸复红染色液作观察细胞分裂时染色体形态的染色剂。染色体染色时，石碳酸复红染色液染色时间较短。较醋酸洋红染色液有很大的优势。

石炭酸复红染色液常用于植物组织的压片法和涂片法，染液稳定，主要用于染色体染色如体细胞染色体和减数分裂染色，是很好的细胞核、线粒体染色剂。

使用步骤（仅供参考）：

1.固定 将经过预处理或没有预处理的材料，放到卡诺氏固定液（3份甲醇：1份冰乙酸）中固定2～24h，再分别在95％ 和85％乙醇中各30min ，再转入70%酒精中，可4℃保存备用。  

2.解离 取固定好的植物组织，用蒸馏水漂洗2～3次，放入1N HCl溶液中60℃水解8～12min，再用蒸馏水洗净。

3.染色 将组织放在载玻片中央，用镊子或解剖针将材料轻轻捣碎。滴加苯酚品红染液，染色8～15min后，盖上盖玻片。  

4.压片 在盖玻片上面铺上滤纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，然后用铅笔的橡皮头轻轻均匀地敲打盖片，至肉眼见材料呈雾状即可，使细胞核染色体分散。 

注意事项： 

    实验用组织4℃保存时间最好不超过二个月。 

  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴手套操作。

    北京上海金畔生物科技有限公司科技有限公司是一家长期从事生化试剂耗材生产也销售的厂家，备有现货产品石炭酸复红染色液，货号是G1160，常卖规格为100ml和500ml两种。科研实验中主要用于细胞核、线粒体染色。