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正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。在没有修复DNA损伤的情况下，为了抑制细胞的癌化，需要不可逆地终止DNA损伤细胞的分裂。细胞衰老是一种可以不可逆地终止DNA损伤细胞分裂的状态，它可以抑制DNA受损细胞的生长。SA-β-gal (细胞衰老β-半乳糖苷酶)在衰老细胞中过表达，被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法，但此方法存在几个缺点：

1)由于细胞透膜性差，需要固定细胞。

2)由于很难区分染色细胞和未染色细胞，所以定量困难。

3)染色时间长。

本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高，方法简便。SPiDER-βGal是一种检测β-gal的新型试剂，具有细胞透膜性高，胞内荧光维持时间长的特点。本试剂盒不仅可以特异性地检测到活细胞中的SA-β-gal(用Bafilomycin A1抑制内源性β-galactosidase的活性)，也可以检测到固定细胞中的SA-β-gal(用McIlvaine缓冲液 (pH 6.0)。由于SPiDER-βGal和SA-β-gal反应后会产生很强且持续的荧光，因此SPiDER-βGal可被用于流式细胞仪来进行定量分析。

由于该试剂盒中的β-半乳糖苷酶检测试剂SPiDER-βGal具有细胞膜通透性，因此无需特别的细胞膜通透性处理或固定细胞，即可直接检测活细胞。穿透细胞膜的SPiDER-βGal通过与SA-β-gal反应发出荧光，并会与附近的蛋白质共价结合。另外，通过在加SPiDER-βGal之前，添加试剂盒内含的Bafilomycin A1，可抑制活细胞中内源性β-半乳糖苷酶的活性，并且抑制背景的状态下检测到SA-β-gal的荧光。

SPiDER-βGal和β-半乳糖苷酶反应的激发和发射光谱图

<推荐波长>

Ex：500~540 nm

Em：530~570 nm

用共聚焦显微镜或流式细胞仪（请选择488 nm激发波长）

特点1：适用于活细胞和固定细胞

检测固定化细胞时，不需要添加Bafilomycin A1，按照说明书记载的操作流程检测SA-βgal。

*活细胞添加Bafilomycin A1的原因：请参阅常见问题“为什么添加Bafilomycin A1？”。

特点2：可定量检测

细胞衰老与细胞周期之间的关系

阿霉素（DOX）会作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖，并诱导细胞衰老。将DOX加入A549细胞后，G2/M期的峰值升高 (Cell Cycle Assay Solution Blue and Deep Red)衰老指标SA-β-gal增强（细胞衰老检测试剂盒-SPiDER-βGal）以及细胞线粒体膜电位降低(JC-1 MitoMP Detection Kit)。

与其他细胞衰老标记物的共染色

本实验是使用本试剂盒对细胞衰老的常用模型多次传代的Wl38细胞 (Passage 的 SA-βgal 进行检测的实例^a）。与其他的细胞衰老标记物γH2AX DNA损伤标记物）的免疫染色^b），以及全细胞的核染色（DAPI）^c）。SA-βgal和γH2AX两种细胞衰老标记物的实验结果相关性得到了验证。^d）

1）将传代1次和10次的Wl 38细胞按照本试剂盒的说明书的“活细胞检测”步骤进行SA-βgal染色。

2）添加4% PFA/PBS，室温培养15 min。

3）PBS清洗细胞3次。

4）加入0.1% Triton X 100/PBS，室温培养30 min。

5）PBS清洗细胞3次。

6）添加1% BSA/PBS，室温培养1 h。

7）用1% BAS/PBS稀释过的抗γH2AX抗体（兔源）加入至细胞后，过夜培养。

8）PBS清洗细胞3次。

9）用1% BAS/PBS稀释过的抗兔二抗（Alexa Fluor 647）加入至细胞后，室温培养2 h。

10）PBS清洗细胞3次。

11）用PBS稀释至 2μg/ ml 的 DAPI 溶液 同仁货号： D523]加入到细胞中，室温培养10 min 。

12）PBS 清洗细胞3 次，用激光共聚焦显微镜观察。

固定WI-38细胞中SA- β-gal与DNA损伤标记物共染

SPiDER-βGal工作液配制

用pH 6.0的McIlvaine 缓冲液稀释SPiDER-βGal DMSO储存液2,000倍。

*固定操作和细胞膜通透性可能会导致灵敏度降低（图1），如果您需要更高的信号，可以将McIlvaine buffer稀释SPiDER-βGal DMSO储存液的倍数调整为500-1000倍（图2）。

McIlvaine buffer（pH6.0）的制备

将3.7ml 0.1 mol/l的柠檬酸溶液和6.3ml 0.2 mol/l的磷酸钠溶液混合。确认pH为6.0，如pH不是6.0，则可通过添加柠檬酸溶液或磷酸钠溶液来调价pH。使用超纯水将该缓冲液稀释5倍。

染色步骤（35 mm 培养皿）

1. 在35 mm 培养皿中接种细胞后，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml PBS洗涤1次后，加入2 ml 4％的多聚甲醛(PFA)/PBS溶液，在室温固定3 min。

*避免延长培养时间，否则容易导致SA-β-gal活性降低

3. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤3次。

4. 加入2 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃培养30 min。

＊用固定细胞检测SA-β-gal时，请不要使用5％ CO2培养箱。如果使用5％ CO2培养箱，SPiDER-βGal工作液会变成酸性，与内源性β-galactosidase发生反应，背景会上升，很难区分正常细胞和衰老细胞。

5. 去除上清液，用2 ml PBS洗涤2次。

6.在细胞中加入0.1% Triton X-100/PBS，并在室温下培养30分钟。

7.用PBS洗涤细胞2次。

8.向细胞中加入1% BSA/PBS，并在室温中培养1小时。

9.向细胞中加入1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体（小鼠），并在4℃孵育过夜。

10.用PBS洗涤细胞3次。

11.向细胞中加入1％BSA/PBS稀释的抗小鼠二抗（Cy5），并在室温下孵育1小时。

12.用PBS洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察。

SA-β-gal检测T细胞（悬浮细胞）

爱媛大学医学院Masakatsu Yamashita教授的研究小组表明，一种叫做menin的蛋白质可以控制T细胞的衰竭和衰老，并维持其正常的免疫功能。

这次通过使用的SPiDER-βGal染色结果确认，我们证实了在白细胞介素2（IL-2）的存在下，对敲除Menin蛋白的CD8阳性细胞通过刺激TCR（T细胞受体），会发生细胞衰老。

染色条件：

① SPiDER-βGal 方法

② X-gal 方法

*数据由爱媛大学医学系Masakatsu Yamashita教授提供

用共聚焦成像细胞仪进行定量用

用共聚焦成像细胞仪（横河电机株式会社CQ1 ）进行衰老细胞定量分析。

■与其他细胞衰老标记物共染色用

SPiDER-βGal 对 SA-β-gal 进行活细胞染色并进行细胞固定和膜透过处理后，对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫荧光染色的 WI-38 细胞，通过共聚焦定量成像细胞仪进行定量和分析。

定量解析

散点图（Scatter Plot）

使用SPiDER-βGal对SA-β-gal 进行染色，其荧光强度作为 Y 轴，以 γ H2AX 的面积与每个细胞核的面积的比值作为 X 轴做成散点图的定量分析。

活细胞荧光染色的分析

X-gal法需要用目视观察总细胞数和衰老细胞的个数，并人工计算衰老细胞的阳性比率。

而使用共聚焦定量成像细胞仪时，用核染色剂（Hoechst 33342）来计数总细胞数 SPiDER-βGal对 SA-β-gal 进行染色来计算衰老细胞数，即可获得衰老细胞的阳性比率。

横河电机

CQ01 拍摄条件

使用孔板：96 孔板

物镜：10 倍

拍摄波长：405 nm Hoechst 33342 Cyan

488 nm （SPiDER-βGal Green）

视野：8视野

*SA-β-gal阳性Wl-38细胞（红色轮廓）

WI-38细胞中的SA-β-gal阳性细胞比例的差异取决于传代次数。与使用X-gal染色方法的手动计数操作相比，使用共聚焦可以快速分析数据。

SA-β-gal的荧光成像

1. 在35 mm μ-Dish（ibidi公司) 中分别接种传代数为0代和12代的Wl-38细胞 (5×10^4 个/dish、 10％ FBS、1％青霉素-链霉素的MEM培养基) 后，在37℃、5％ CO2培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃，5％ CO2培养箱中培养1 h。

4. 将1 ml SPiDER-βGal 工作液和1 μl浓度为1 mg/ml 的Hoechst 33342溶液混合后加入培养皿中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次.

6. 加入2 ml HBSS后，用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长：488 nm，发射波长：500-600 nm)。

用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞

1. 在35 mm μ-Dish (ibidi公司) 中分别接种传代数为1代和12代的Wl-38细胞(1×10⁵ 个/dish，含有10％ FBS，1％青霉素-链霉素的MEM培养基)后，在37℃、5％ CO₂培养箱中过夜培养。

2. 去除培养基，用2 ml HBSS洗涤1次。

3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后，在37℃、5％ CO₂培养箱中培养1 h。

4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后，在37℃，5％ CO₂培养箱中培养30 min。

5. 去除上清液，用2 ml HBSS洗涤2次。

6. 用胰蛋白酶消化细胞，将细胞用MEM培养基 (含有10%的FBS、1%的青霉素-链霉素)重悬。

7. 用流式细胞仪检测 (激发波长：488 nm，发射波长：515-545 nm)。