(2S,3R,4S,5R,6R)-2-{[3′-(Diethylamino)-5′-(fluoromethyl)-3H-spiro(isobenzofuran-1,9′-xanthen)-6′-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol

CAS号：1824699-57-1

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源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）被广泛用作报告基因分析标记。X-gal染色被广泛用作检测β-半乳糖苷酶的典型方法，但是由于细胞膜通透性差，必须固定细胞和组织。另外由于常规的β-半乳糖苷酶检测荧光剂仅具有较低的细胞内滞留性，所以存在不能清楚地区分不表达β-半乳糖苷酶的细胞和表达β-半乳糖苷酶的细胞的问题。
为了克服这些问题，浦野、神谷等研究者成功开发出了具有细胞膜穿透性和细胞内滞留性的新荧光试剂SPiDER-βGal 。该试剂通过与β-半乳糖苷酶的酶促反应形成中间体醌甲基化物，并与蛋白质中的SH基等亲核基团形成稳定的共价键，并发出荧光。以此方式，将反应的试剂固定在细胞内蛋白上并具有优异的细胞内滞留性，结果证明可以在单个细胞水平上清楚地检测到表达β-半乳糖苷酶的细胞。

SPiDER-βGal的细胞染色原理

SPiDER-βGal透过细胞膜后，在β-半乳糖苷酶的酶促反应下迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，可以和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光，并可以自我固定在细胞内的蛋白质上而滞留在细胞内。

          加入试剂                                 培养15分钟                                 观察

用缓冲液清洗细胞后，              在避光条件下培养15分钟，           用荧光显微镜或流式细胞仪

加入SPiDER-βGal染色液。               用缓冲液清洗细胞。                                观察。

组织的荧光成像

果蝇组织的实时成像
（数据由东京大学大学院医学系研究科浦野泰幸教授提供）

活细胞和固定细胞的荧光成像

SPiDER-βGal对HEK/LacZ细胞和细胞数比为1:1的HEK细胞的染色图
A.活细胞，B.固定细胞（4％PFA/PBS）
（绿色：SPiDER-βGal，蓝色：Hoechst 33342）

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合培养，分别在固定前和固定后用SPiDER-βGal染色，用共聚焦显微镜观察。证实了由于SPiDER-βGal具有很好的膜通透性和能在细胞内长时间滞留，可以在固定前和固定后进行荧光成像。

用流式细胞仪检测表达β-半乳糖苷酶的细胞

使用SPiDER-βGal通过流式细胞仪对HEK/LacZ细胞和HEK细胞分别进行检测。

将HEK293细胞和β-半乳糖苷酶稳定表达的HEK/LacZ细胞以1:1的比例混合并培养，并在用SPiDER-βGal染色后用流式细胞仪进行检测。通过在细胞中滞留的SPiDER-βGal，可以区分β-半乳糖苷酶稳定表达菌株（绿色）和非表达菌株（灰色）。

组织样品中的SA-β-gal检测

有研究人员发表了一篇论文，其中使用糖尿病模型小鼠的组织样本通过SPiDER-βGal检测到了SA-β-gal。

<组织样本的染色条件>
将快速冷冻的组织切片后，将其浸入4％多聚甲醛中，并在室温下培养20分钟。然后将20 μmol/l SPiDER-βGal加到用PBS洗涤过的样品中，并在37℃培养1小时。 最后将样品用PBS洗涤并观察。

有关实验操作和数据的详细信息，请参阅以下参考文献中的5）。

SPiDER-βGal与β-半乳糖苷酶反应后的激发/发射光谱

<推荐滤波片>
激发：500-540 nm
荧光：530-570 nm
使用共聚焦激光显微镜和流式细胞仪
我们有使用488 nm激发进行检测的记录。

Q：与现有方法相比是否有相关性以及这个方法的优点。

A：①可用于活细胞。我们证实与同样用于活细胞的GFP融合蛋白表达细胞的方法存在相关性。 （2）与GFP方法相比，即使固定后也可以观察到荧光。 （3）与现有的小分子量β-半乳糖苷酶荧光检测试剂相比，具有优异的“细胞膜通透性”和“细胞内滞留性”，因此可以在单个表达β-半乳糖苷酶的细胞上染色。

Q：除了Hanks’ HEPES以外，还可以用其它工作液吗？

A：可以使用PBS，HBSS等。

Q：工作液稳定吗？

A：不能长时间保存，需要现配现用。

Q：可以用流式细胞仪检测吗？

A：可以，用流式细胞仪可以检测β-半乳糖苷酶表达和未表达的HEK细胞的混合样品并分离。 在说明上有操作步骤和实验条件。

Q：是否可以固定后再对样品染色？

A：可以，即使用4%的多聚甲醛或甲醇固定，也可以进行荧光观察。由于固定会降低β-半乳糖苷酶的活性，请摸索最佳固定条件。

Q：推荐的滤光片。

A：建议使用以下滤光片。 ・荧光显微镜：激发（500-540   nm），荧光（500-540 nm） ・流式细胞仪：激发（488   nm），荧光（500-540 nm） 请参考说明书中的“激发/发射光谱”和实验例。

Q：样品染色后是否可以固定？

A：可以。即使将其固定在4％多聚甲醛或甲醇中，也可以观察到荧光。

Q：是否可以染组织？

A：可以。与细胞染色相比，组织染色需要增加工作液的浓度（例如10-20 μmol/l）， 我们有组织染色的实验例。

1) Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution,Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,2016,doi:10.1002/anie.201603328

2) Changes in expression of C2cd4c in pancreatic endocrine cells during pancreatic development,FEBS Lett.,2016,doi:10.1002/1873-3468.12271

3) A topically-sprayable, activatable fluorescent and retaining probe, SPiDER-βGal for detecting cancer; Advantages of anchoring to cellular proteins after activation ,Oncotarget,2017,doi:10.18632/oncotarget.17080.

4) Developmental vascular remodeling defects and postnatal kidney failure in mice lacking Gpr116 (Adgrf5) and Eltd1 (Adgrl4),PLoS ONE.,2017,10.1371/journal.pone.0183166.

5) Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality,NPJ. Aging Mech. Dis.,2017, DOI:10.1038/s41514-017-0012-0.

6) Ecrg4 deficiency results in extended replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner,Development,2019,doi:10.1242/dev.168120 .

7) Activity and intracellular localization of senescence-associated β-galactosidase in aging Xenopus oocytes and eggs,Exp. Gerontol.,2019,119,157.

8) β-Hydroxybutyrate Prevents Vascular Senescence through hnRNP A1-Mediated Upregulation of Oct4,Molecular Cell,2019,71,1064-1078.

9) Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype,Nature Commun.,2020,11,481.