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品牌：Enzo
CAS No.：202463-68-1 储存条件：+4℃ 纯度：– |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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ALX-270-240-M005 |
– | 5 mg | – | 1,320.00 | – | – |
* 干冰运输、大包装及大批量的产品需酌情添加运输费用
* 零售价、促销产品折扣、运输费用、库存情况、产品及包装规格可能因各种原因有所变动，恕不另行通知，确切详情请联系上海金畔生物科技有限公司。
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品牌：Chemodex
CAS No.：126150-97-8 储存条件：-20°C 纯度：>95% (HPLC) |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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CDX-B0285-M025 |
– | 25 mg | – | 1,410.00 | – | – |
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品牌：Chemodex
CAS No.：121714-22-5 储存条件：-20°C 纯度：>90% (TLC) |
| 产品编号
(生产商编号) |
等级 | 规格 | 运输包装 | 零售价(RMB) | 库存情况 | 参考值 |
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CDX-F0033-M010 |
– | 10 mg | – | 28,060.00 | – | – |
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特点：
● 活细胞荧光染色的同时也可间接判断细胞活性
● 自荧光显色，成像效果好
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凑单关联产品TOP5
NO.1. Cell Counting Kit-8 细胞增殖毒性检测
NO.2. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 乳酸脱氢酶(LDH)检测
NO.3. FerroOrange 细胞亚铁离子检测
NO.4. Cellstain- PI 细胞核染色
NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测
规格性状
规格
特性：该产物为无色至微黄色固体，可溶于二甲基亚砜和乙腈。
可溶于二甲基亚砜：试验成功
NMR光谱：试验成功
产品概述
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，由于它在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂 (如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate) 相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。使用了Calcein的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。
Calcein-AM可与PI结合使用，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。
*Caution*
Please tap the tube before opening, and open it with care. The content may have relocated from the bottom of the tube during the shipping.
*警告*
打开前请先轻敲试管，并小心打开。 在运输过程中，内装物可能已从试管底部移开。
原理
Fig. 1 Cell staining mechanism
产品特性
钙黄绿素-AM通过钙黄绿素的四个羧基的乙酰氧基甲基酯化（AM转化）而使其可透过细胞膜。钙黄绿素-AM本身几乎不显示荧光，但通过细胞内酯酶水解变成钙黄绿素。该钙黄绿素是不透膜的化合物，表现出强的黄绿色荧光（λex= 490 nm，λem= 515 nm）。羧基荧光素二乙酸盐（CFDA）和荧光素二乙酸盐（FDA）与荧光素-AM具有相同的荧光素骨架，被称为染色活细胞的染料。但是，这些化合物在显色后容易从细胞膜泄漏，这已成为使用中的问题之一。与这些染料相比，钙黄绿素-AM越来越多地用作显色后从细胞泄漏较少的染料。还已知它不抑制细胞功能，例如淋巴细胞增殖和白细胞趋化性。另外，钙黄绿素-AM在利用杀伤性T细胞和NK细胞的细胞毒性活性的测定中，与使用广泛使用的放射性同位素的51Cr释放方法得到相同的结果，因此细胞毒性较小。钙黄绿素-AM对活细胞染色，并用于在荧光显微镜和流式细胞仪下观察，但是当与死细胞染色染料组合使用时，常用于活细胞和死细胞的双重荧光染色。Papadopoulus等人使用Calcein-AM和Ethidium homodimer（EthD-1）进行双重染色，并使用两种染料的荧光波长差异通过流式细胞术研究细胞毒性。钙黄绿素-AM目前是用于染色活细胞的最有用的染料，因为它的细胞毒性较小，荧光后细胞泄漏较少。如上所述，目前正在使用放射性同位素的测量方法，但是从安全性和便利性的角度出发，期望使用荧光化合物的细胞研究的分析将继续进行。
荧光特性
λex=490 nm, λem=515 nm
操作说明
1. 用1ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l的Calcein-AM母液，-20℃下密闭冷冻保存。
2. 用PBS将Calcein-AM母液稀释制成1-50 µM的Calcein-AM溶液(现配现用)。
3. 吸掉预培养好的细胞中的培养基，用合适的缓冲液清洗2-3次。a)
4. 加入适量的Calcein-AM溶液，在37℃培养细胞15-30分钟。
5. 用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。
6. 用490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 如果Calcein-AM很难进入细胞，可以使用表面活性剂，如Pluronic® F127。
参考文献
1) K. McGinnes, G.Chapman, R.Marks and R.Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1986,86,7.
2) S.J.Morris,”Real-time Multi-wavelength Fluorescence Imaging of Living Cells”, BioTechniques,1990,8(3),296.
3) S.A.Weston and C.R.Parish,”New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”, J.Immunol.Methods,1990,133,87.
4) D.M.Callewaert,G.Radcliff,R.Waite,J.Lefevre and D.Poulik,”Characterization of Effector-Target Conjugates for Cloned Human Natural Killer and Human Lymphokine Activated Killer Cells by Flow Cytometry”,Cytometry,1991,12,666.
5) Han-Qing Xie, R.Huang and V.W.Hu, “Intercellular Communication Through Gap Junctions Is Reduced in Senescent Cell”, Biophys.J,1992,62,45.
6) S.A.Weston and C.R.Parish,”Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13,739.
7) X.M.Wang, P.I.Terasaki,G.W. Rankin Jr. ,D.Chia,H.P.Zhong and S.Hardy,”A New Microcellular Cytotoxicity Test Based on Calcein AM Release”, Hum. Immunol.,1993,37,264.
8) N.G.Papadopoulos,G.V.Dedoussis,G.Spanakos,A.D.Gritzapis, C.N.Baxevanis and M.Papamichail,”An Improved Fluorescence Assay for the Determination of Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Using Flow Cytometry”, J.Immunol.Methods,1994,177,101.
9) L.S.De Clerck,C.H.Bridts,A.M.Mertens,M.M.Moens and W.J.Stevens,”Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”, J.Immunol. Methods,1994,172,115.
10) H.Ohata,Y.Ujiki and K.Momose,”Confocal Imaging Analysis of ATP-Induced Ca2+ Response in Individual Endothelial Cells of the Artery in Situ”, Am.J.Physiol. ,1997,272(6),1980.
常见问题Q&A
| Q1：与51Cr释放方法有关吗 |
| A1: “钙黄绿素-AM与51Cr释放方法之间存在相关性。
以下文件中有一份报告。N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)” |
| Q2：细胞染料的激发波长和发射波长是多少。 |
| A2： |
| Q3:细胞染色试剂Cellstain的哪些活细胞染色染料可以在细胞中长时间停留？ |
| A3: “就细胞内保留而言，“ CFSE”可以在细胞中停留最长时间。尽管荧光强度降低，但是已经证实细胞中存在荧光染料达8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”观察到荧光达3天。也有报道称“钙蛋白-AM”在6小时内在细胞中保留了90％”
・S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990) ・H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)” 但是，“钙调蛋白-AM”和“ BCECF-AM”对细胞毒活性没有影响。 ・L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994) 还要注意的一点是，原始的基本骨架是荧光素，因此由于激发光而褪色由于容易发生，因此可能难以通过长期激发来观察荧光。 （尽管最好使用防褪色剂等） |
| Q4：如何使用Calcein-AM。 |
| A4：下面以HeLa细胞的情况为例进行介绍。
根据细胞类型和观察条件考虑并固定试剂浓度。 【试剂】 溶液A：将1 mg钙黄绿素-AM溶于1 ml DMSO→1 mmol / L溶液 *将溶液存放在-20°C的阴凉处，以防止变质。 溶液B：用PBS（-）将溶液A稀释500倍（用5 mL PBS稀释10μl溶液A得到2μmol/ L）。 * Calcein-AM在水溶液中分解，因此在使用前请准备溶液B。 【操作】 1）用胰蛋白酶-EDTA收集HeLa细胞并制备细胞悬液。 2）离心细胞悬液（1,000 rpm，3分钟） 3）除去上清液并添加PBS（-）（此时，准备细胞数为105至106细胞/ mL）。 4）用移液器充分分散。 *由于培养液中的血清可能会升高背景，请执行操作2）至4）。 重复并彻底清洗。 5）将30μl在4）中获得的细胞悬液添加至1.5ml微管中。 6）向其中加入15μL[液体B]。 7）盖上微管并在37°C下孵育15分钟。 8）将10μL7）的溶液放在盖玻片上，从上方堆叠盖玻片，然后将染色的细胞悬液夹在中间。 9）将盖玻片放在荧光显微镜下，用490 nm的滤光片激发，观察发出黄绿色荧光的活细胞。 （对于滤光片，如果是490±10 nm，则可以观察到） *排除血清和酚红，因为它们是背景。 *如果背景很高，请清洁它。 *在载玻片上培养的细胞可以用相同的方式染色和观察。 *有关使用PI的双重染色方法，请参阅方案“我要分别对活细胞和死细胞进行染色”。 |
| Q5：我已经购买了钙黄绿素-AM（粉末），并希望将其制成溶液。 我该怎么办？ |
| A5:溶于DMSO。
分子量几乎为1000，因此，如果将1 mg溶于1 mL DMSO，它将是1 mM的溶液。 请使用尽可能干燥的DMSO。 |
关联产品
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C44H47N3O24
1001.85
特点：
● 双波长激发检测钙离子
● 激光共聚焦，流式细胞仪均可检测
● 荧光强度高
产品性状
| 规格
性状 ： 本产品为黄色或橙黄色粉末，使用时将固体溶解于无水DMSO中 纯度（HPLC）: 98%以上 荧光光谱图： 符合实验要求 NMR光谱图： 符合实验要求 处理条件 保存方法 ： 避光冷冻 |
产品概述
Fura 2-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura 2-AM的荧光比较弱，最大激发波长为369 nm，最大发射波长为478 nm，并且其荧光不会随钙离子浓度改变而改变。Fura 2-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura 2，从而被滞留在细胞内。Fura 2和钙离子结合后，最大激发波长为335 nm(最大激发波长随离子浓度的的不同而有所不同)，最大发射波长为505nm。实际检测时推荐使用的激发波长为340nm，发射波长为510 nm。如果做双波长检测，则推荐使用的激发波长为340 nm和380 nm。
原理
Fura 2可以和钙离子(Ca2+)结合，结合钙离子后在330-350 nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380 nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340 nm和380 nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。
激发发射波长
Ex ：340～380 nm
Em ：510 nm
操作步骤
1、用HBSS溶液稀释1-5 mmol/l的Fura 2-AM母液，配制成1-5 μmol/l的Fura 2-AM工作液。
（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）
例如:1 mmol/l母液配制1 ml浓度为5 μmol/l工作液的方法：用1 ml HBSS溶液稀释5 μl母液即可。
如果Fura 2-AM进入细胞效果不好，可使用Pluronic® F-127后者可以防止Fura 2-AM在缓冲液里聚合
并能促进其进入细胞。
*Pluronic® F-127先用DMSO溶解至浓度为20%（W/V），然后根据实验需要直接加入Fura 2-AM工作液中
至终浓度为0.04-0.05%（此浓度仅供参考，请根据具体实验要求自行调整）。
2、取出预培养的细胞，除去培养基，使用HBSS溶液洗涤细胞3次。
如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解AM体,从而降低Fura 2-AM进入细胞的效果。
另外含有酚红的培养 基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
3、加入Fura 2-AM工作液，溶液量以覆盖细胞为准。
4、37℃细胞培养箱孵育10-60分钟，除去Fura 2-AM工作液。关于孵育的时间，
如果首次做实验不能确定，建议先孵育30分钟，看荧光效果:如果细胞死亡较多，缩短时间；
荧光强度太弱，延长时间。
5、用HBSS溶液洗涤细胞3次，以充分去除残留的Fura 2-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。
6、37℃培养箱孵育约20-30分钟，以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。如果细胞内酯酶活性较低，
建议严格按照此操作进行；酯酶活性高的细胞实验，可以忽略此步。
7、用流式细胞仪或其它设备检测细胞，激发波长380 nm（Fura 2）和340 nm（钙离子-Fura 2)
发射波长510 nm。
注意事项
1、试剂容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，
开封前，请轻弹管壁几次，以保证粉末落入管底。
2、第一次使用时, 建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。
3、溶解液DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
4、母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成5 μl/管，用封口膜封口，
并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。
5、建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件
数据处理
Fλ1与Fλ2分别是λ1与λ2激发时的总荧光强度，Sf 1与Sf 2是两种紫外光激发时游离Fura-2 (未结合Ca2+)的荧光系数，
Cf是游离的Fura-2浓度，Sb1与Sb2是相应波长下结合Ca2+后Fura-2的荧光系数，Cb是结合Ca2+的Fura-2浓度
参考文献
1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440.
2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, “Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2”, Nature, 1985, 318, 558.
3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, “Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths”, Cell Calcium, 1985, 6, 145.
4) D. A. Williams and F. S. Fay, “Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2”, Cell Calcium, 1990, 11, 75.
5) W. Almers and E. Neher, “The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading”, FEBS Lett., 1985, 192, 13.
6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, “Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 132, 652.
7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, “Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1987, 45, 429.
8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, “Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1993, 61, 165.
Q&A
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Q1: 细胞内检测钙离子的试剂种类都有什么，选择什么样的比较好呢？ |
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A1: 根据检测仪器和检测波长有很多的选择，产品后面标有AM的试剂是可以通过细胞膜的 有很多种相似的试剂，其特点如下： 【Fura 2】 •双波长激发 激发(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、发射：λem=500 nm •解离常数：224 nmol/L •因为是荧光强度的比值、可以有效的减小误差 =>細胞内Ca浓度计算。 •该试剂被使用的最多 •必须要更换过滤片、会耽误一些时间。 【Fluo 3】 •单波长激发 激发：λex=508 nm、发射：λem=527 nm •解离常数：400 nmol/L •因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小 （不会受到NADH、NADPH的影响） •可以使用Ar激光激发装置。 •不适合切片中钙离子的检测 •【Fluo 4】 •单波长激发 •激发：λex=495 nm、发射：λem=518 nm •解离常数：360 nmol/L •与Fluo3相比对荧光强度更高。 •因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小 •（不会受到NADH、NADPH的影响） •可以使用Ar激光激发装置。 •与Fluo3相比对細胞的毒性低 •【Indo 1】 •单波长激发 •激发：λex= 330 nm、发射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm) •解离常数：250 nmol/L •由于不需要更换滤光片，可以很快地检测细胞内钙离子浓度变化以及像心肌细胞运动中钙离子的变化 •（需要两台检测仪器） •【Rhod 2】 •单波长激发 •激发：λex=553 nm、发射：λem=576 nm •解离常数：1.0 μmol/L •因为激发光在长波段，所以对细胞的损伤比较小 •（不会受到NADH、NADPH的影响） •可以使用Ar激光激发装置。 •【Quin 2】 •单波长激发 •激发：λex=339 nm、发射：λem=492 nm •解离常数：110 nmol/L •最早开发的产品 |