细胞衰老的特征

近几年发现了细胞衰老及具有致癌因子的衰老相关分泌表型（SASP）。在干细胞等领域均发现有衰老现象，在各领域的衰老研究受到越来越多的重视。

通过不同指标评估衰老细胞

在不同传代数的WI-38细胞中，使用不同的试剂盒分别评估细胞的SA-ß-Gal活性，线粒体膜电位和细胞代谢情况（葡萄糖和乳酸）。在衰老细胞中，SA-ß-Gal活性增强，线粒体膜电位降低。其上清液中葡萄糖和乳酸的消耗量等代谢指标有所增加。

细胞老化导致相关因素的变化

引用论文

① H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, N. Saitoh, S. Hino and M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Reports, 2017, 18(9), 2148.
② L. Garcia-Prat, M. Martinez-Vicente and P. Munoz-Canoves, “Autophagy: a decisive process for stemness”, Oncotarget, 2016, 7(11), 12286.
③ M. Bitar, S. Abdel-Halim and F. Al-Mulla, “Caveolin-1/PTRF upregulation constitutes a mechanism for mediating p53-induced cellular senescence: implications for evidence-based therapy of delayed wound healing in diabetes”, Am J Physiol Endocrinol Metab., 2013, 305(8), E951.
④ C. Wiley, M. Velarde, P. Lecot, A. Gerencser, E. Verdin, J. Campisi, et. al., “Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype”, Cell Metab., 2016, 23(2), 303.
⑤ E. Liao, Y. Hsu, Q. Chuah, Y. Lee, J. Hu, T. Huang, P-M Yang & S-J Chiu, “Radiation induces senescence and a bystander effect through metabolic alterations.”, Cell Death Dis., 2014, 5, e1255.
⑥ K. Nishimura, T. Kumazawa, T. Kuroda, A. Murayama, J. Yanagisawa and K. Kimura, “Perturbation of Ribosome Biogenesis Drives Cells into Senescence through 5S RNP-Mediated p53 Activation”, Cell Rep. 2015, 10(8), 1310.
⑦ M. J. Son, Y. Kwon, T. Son and Y. S. Cho, “Restoration of Mitochondrial NAD+ Levels Delays Stem Cell Senescence and Facilitates Reprogramming of Aged Somatic Cells”, Stem Cells. 2016, 34(12), 2840.

通路图

铁死亡通路图下载

各类指标

铁死亡检测各项指标方法及对应实验结果，详见：

干货｜细胞铁死亡（Ferroptosis）——细胞死亡的新模式

实验例

在铁死亡研究中测量谷氨酰胺/谷氨酸水平

众所周知，通过蛋白处理抑制xCT时，会引起铁依赖性细胞死亡，称为“ Ferroptosis”，使用蛋白处理后的A549细胞测定了谷氨酸的释放量和细胞内谷胱甘肽的含量。 蛋白处理过的A549细胞中的谷氨酸释放减少，并且通过抑制胱氨酸的摄取减少了细胞内谷胱甘肽的量。

铁死亡过程中各指标的波动

1. Mon, E. et al., “Regulation of mitochondrial iron homeostasis by sideroflexin 2”, The Journal of Physiological Sciences, 2019, 69(2), 359–373.DOI: 10.1007/s12576-018-0652-2

2. Takashima, M. et al., “Neuroprotective effects of Brazilian green propolis on oxytosis/ferroptosis in mouse hippocampal HT22 cells”, Food and Chemical Toxicology, 2019, 132, 110669.DOI: 10.1016/j.fct.2019.110669

3. Wang, Y. et al., “PM2.5 induces ferroptosis in human endothelial cells through iron overload and redox imbalance”, Environmental Pollution, 2019, 254(A), 112937.DOI: 10.1016/j.envpol.2019.07.105

4. Yambire, K. et al., “Impaired lysosomal acidification triggers iron deficiency, necrotic cell death and inflammation in vivo”, bioRxiv, 2019,DOI: 10.7554/eLife.51031

5. Kagan, V. et al., “Oxidized Arachidonic/Adrenic Phosphatidylethanolamines Navigate Cells to Ferroptosis”, Nat. Chem. Biol., 2017, 13(1), 81.DOI: 10.1038/nchembio.2238

6. Dar, H. et al., “Pseudomonas aeruginosa utilizes host polyunsaturated phosphatidylethanolamines to trigger theft-ferroptosis in bronchial epithelium”, J Clin Invest. 2018, 128(10), 4639-4653.DOI: 10.1172/JCI99490

7. Totsuka, K. et al., “Oxidative stress induces ferroptotic cell death in retinal pigment epithelial cells”, Experimental Eye Research, 2019, 181, 316-324.DOI: 10.1016/j.exer.2018.08.019

8. Fujiki, K. et al., “Blockade of ALK4/5 signaling suppresses cadmium- and erastin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial cells via distinct signaling mechanisms.”, Cell Death Differ. 2019, 26(11), 2371-2385.DOI: 10.1038/s41418-019-0307-8

脂质过氧化物检测

更多脂质过氧化物实验例详见：

如何Get铁死亡-脂质过氧化物实验的正确打开方式？

使用共聚焦显微镜观察L929细胞的细胞内脂质过氧化物的变化。实验的详细信息请参照我们公司的网站。

t-BHP: tert butyl hydroperoxide

<数据提供>

日本北里大学药学部

今井浩孝老师，熊谷刚老师

胞内铁离子检测

<检测条件>

Ex: 561nm  Em: 570-620 nm

比例尺：20 μm

谷氨酸、谷胱甘肽等检测

组织样品中的铁离子检测

Iron Assay Kit三大特点

1.经典比色法，操作简单快捷。

2.二价铁和三价铁均可检测。

3.Excel模板自动计算铁浓度。

加标回收实验验证试剂盒准确性

*加标回收率 是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。结果越接近100%，说明检测结果越准确。

相关疾病研究

非酒精性脂肪肝

通过铁死亡抑制肝炎

一项使用 NASH 模型小鼠肝脏的研究证实，在脂肪肝开始时，坏死发生在细胞凋亡之前。 在更详细的实验中，报道了铁死亡与坏死中脂肪性肝炎的触发有关，并且在铁死亡抑制实验中几乎可以完全抑制肝炎的发作。

Minoru Tanaka, et al., “Hepatic ferroptosis plays an important role as the trigger for initiating inflammation in nonalcoholic steatohepatitis”, Cell Death & Disease, 2019, 10, 449.

神经退行性疾病

溶酶体疾病与铁死亡之间的关联

在使用神经元细胞的实验当中，证实敲低溶酶体蛋白 Prosaposin 之后诱导了铁死亡，并且诱导了脂褐素形成和活性氧的产生，这两个指标也是衰老的特征。

Martin Kampmann, et al., “Genome-wide CRISPRi/a screens in human neurons link lysosomal failure to ferroptosis”, Nature Neuroscience, 2021, 24, 1020

癌症

通过铁死亡控制癌症免疫

发现免疫疗法激活的 CD8 + T 细胞通过促进脂质过氧化和导致铁死亡来促进抗肿瘤作用。 该过程被发现是通过免疫疗法抑制胱氨酸的摄取和促进肿瘤细胞脂质过氧化的机制。

Weiping Zou, et al, “CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy”, Nature, 2019, 569, 270

铁

认识到铁在地球生命活动和疾病中的重要性

与铁死亡密切相关的铁研究综述。 有关铁动力学、过量铁引起的致癌作用和关联病信息。

名古屋大学大学院医学系研究科　病理病態学講座　生体反応病理学・分子病理診断学　教授　豊國 伸哉, Dojin News, 2017, 162, 1

线粒体自噬试剂盒原理：

记载了本产品的检测原理和实验例的论文请看MD01论文实验例中第四篇：Live Cell Imaging of Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent Small Molecule

细胞自噬流程图：

自噬试剂原理：

DAPGreen和DALGreen在头部具有末端氨基功能的化学结构（该结构如磷脂酰乙醇胺）该结构的一部分嵌入在疏水膜环境中。

自噬隔离膜在形成中被DALGreen和DAPGreen处理的共聚焦显微镜图像 比例尺：20 μm

当自噬体膜形成时，DAPGreen嵌入膜内。嵌入的DAPGreen是一种pH不敏感探针，在亲脂性条件下，其荧光增强。

当自噬体的膜形成时，DALGreen同样会嵌入膜内，DALGreen是一种pH敏感探针，在酸性条件下，自噬体与溶酶体结合后荧光增强。

实验例：

1.DALGreen与LC3的高度相关性

用1 μmol/l的DALGreen染色后，用无氨基酸培养基分别培养HeLa细胞0、2、4、6h。

用20 μm/l抗LC3抗体和抗肌动蛋白抗体检测的LC3 I-和LC3 II的相对表达水平并用免疫印迹分析法验证其相对表达水平。

结果证明DALGreen荧光强度的增加与LC3-I, LC3-lI转化率相关。

2.自噬细胞的荧光成像

用1 μmol/l DALGreen染色后，并用野生型和ULK 1/ULK2 DKO的MEF细胞分别进行处理（或不处理）

并添加雷帕霉素和氯喹8小时后。在ULK1/ULK2双敲除(DKO)MEF细胞中几乎没有观察到DALGreen荧光信号，

对酵母的同源功能有缺陷Atg1蛋白，即使存在氯喹(COL)。DALGreen荧光信号也正确反映了自噬的发生。

3.对自噬细胞抑制处理后的荧光成像

在3-Methyladenine(3-MA)存在的情况下，饥饿HeLa细胞的DALGreen荧光值降低。

样品：5小时饥饿的HeLa细胞，DALGreen:1 μmol/l，3-MA:5 mmol/l，比例尺：20 μm

4.DAPGreen和tagRFP-LC3共染

DAPGreen荧光信号与tagRFP-LC3信号有高度相关性，且DAPGreen和tagRFP-LC3都可以染色活细胞。

样本:tagRFP-LC3表达MEF细胞。DAPGreen: 0.1 μmol/l，比例尺：10 μm

5.DAPGreen和Lamp1-tagRFP共染色

从溶酶体中可观察到大量DAPGreen荧光信号并看到DAPGreen与Lamp 1-tagRFP

(溶酶体染色探针)存在共定位关系。因为DAPGreen不仅染色自噬体，而且也染色自噬溶酶体。

样本:Lampl-tagRFP表达的MEF细胞  DAPGreen: 0.1 μmol/l，比例尺:10 μm

6.DALGreen和tagRFP-LC3共染

几乎所有的DALGreen荧光信号都与LC3存在共定位关系。tagRFP-LC3

不仅染色自噬体也染色自溶酶体，而DALGreen的荧光信号表示细胞中有自噬溶酶体的存在

样本: tagRFP-LC3表达MEF细胞  DALGreen:1 μmol/l，比例尺:10 μm

7.DALGreen和Lamp1-tagRFP共染

几乎所有的DALGreen都与Lamp1-tagRFP共定位。Lamp-tagRFP染色溶酶体，

而DALGreen的荧光信号表示细胞中有自噬溶酶体的存在

样本：Lamp1-tagRFP表达的MEF细胞，DALGreen:1 μmol/l，比例尺：10 μm