嘌呤霉素的作用有哪些

嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一种抗生素，广泛用作蛋白质合成的抑制剂。其结构与氨酰tRNA 3′端上的AMP结构相似，肽酰转移酶能促使氨基酸与嘌呤霉素结合形成肽酰嘌呤霉素，从核糖体上脱落，从而使蛋白质合成反应中断。嘌呤霉素的作用如下：

嘌呤霉素的作用：

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，嘌呤霉素Puromycin通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。嘌呤霉素Puromycin某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素Puromycin作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素Puromycin抗性基因：

对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的?Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomycesalboniger。

嘌呤霉素Puromycin最普遍应用：

1）嘌呤霉素作用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。

2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。

化学特性：化学名称：<b

</b

3(a-Amino-p-methoxyhydro?cinnamamido)-3–deoxy-N,N–dimethyladenosine·2HClCAS

No.：58-58.2，

分子式：C22H29N7O5.2HCl，

分子量：544.43g/mo

纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。

嘌呤霉素Puromycin应用浓度：哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10?μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

嘌呤霉素可由白色链球菌（Streptomyces.alboniger）发酵制得的抗生素。熔点175.5～177.0℃。旋光度-11 （乙醇）。在酸性溶液中分解成为6-二甲胺嘌呤，O-甲基-L-酷氨酸及3-氨基-3-去氧核糖。结构与氨基酰tRNA分子中腺苷相连结的氨基酸末端基因相似，因而它可作氨基酰tRNA的类似物，从而取代一些氨基酰tRNA进入核糖体的A位与正在延伸的多肽链结合，当延长中的肽转入此异常A位时，容易脱落，以肽基嘌呤霉素的形式从核糖核蛋白体上早期解离,终止肽链合成,从而抑制了蛋白质的合成。由于嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用，故难于用做抗菌药物，嘌呤霉素作用于研究蛋白质合成的生物化学工具。有人试用于肿瘤治疗。

上海金畔生物科技有限公司细胞凋亡检测试剂盒的原理及使用说明

细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡是为维持环境稳定，为更好的适应胜春环境而主动争取的一种死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，是一种字体损伤的现象。

细胞凋亡检测试剂盒原理

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一种分子量为35.8 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光，区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。

细胞凋亡检测试剂盒使用步骤

1. 调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。

2. 取1ml细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。

3. 加入1ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清（对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤）。

4. 重复步骤3两次。

5. 将细胞重悬于200μl Binding Buffer。

6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟 或4℃反应30 分钟。

7. 加入300μl Binding Buffer，在1小时内用流式细胞仪检测。

8. 若用荧光显微镜检测，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。

使用细胞凋亡检测试剂盒的注意事项

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在保存与操作时请注意避光。

3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用。

4.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。

5.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

6.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。

7.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变。

8.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的。

北京上海金畔生物科技有限公司科技有限公司自产细胞凋亡检测试剂盒货号为CA1020，常卖规格为20T、50T、100T。上海金畔生物科技有限公司公司专业生产销售生化试剂，细胞培养基，实验耗材等产品，专注科学研究。

琼脂糖凝胶与核酸电泳小知识

影响核酸电泳迁移率的几个因素

1、核酸分子大小

在一定浓度的琼脂糖凝胶中，DNA片段迁移距离和其含有的碱基对数量成反比，因此可以通过与标准条带迁移距离进行比较，由此得出目的条带的大小，但这仅对双链线性的DNA比较准确（DNA Marker一般为双链线状DNA），且对大于20kb的DNA不适用（普通琼脂糖凝胶很难将其分开）。

2、核酸分子构象

DNA分子在电场中的迁移速度不仅和分子量有关，还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的移动速度不一样，移动速度次序为：共价闭环DNA>线性DNA>开环DNA。当琼脂糖浓度太大时，环状的DNA一般不能进入胶内（停留在孔中）。

3、琼脂糖浓度

同样的线状DNA分子在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，DNA电泳迁移率的对数和琼脂糖凝胶浓度呈线性关系，凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。

琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

凝胶浓度（%）           线性DNA长度（bp）

    0.5                           1000~30000

    0.7                           800~12000

    1.0                           500~10000

    1.2                           400~7000

    1.5                           200~3000

    2.0                           50~2000

4、电源电压

在低电压时，线状DNA片段的迁移速率和所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分离率达到最大，所使用的电压不得超过5V/cm。

5、电泳方式

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。垂直型电泳，一般用聚丙烯酰胺凝胶做为支撑物。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。

6、嵌入染料的存在

常用的荧光染料EB可以嵌入到堆积的碱基对之间，使其刚性更强，并使其迁移速率有所下降。

7、电泳缓冲液的离子强度

电泳缓冲液的组成和离子强度也能影响DNA的迁移速度。在离子存在很少的情况下（如无用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误用10×电泳缓冲液），则电导率很高并产热明显，严重时能引起凝胶融化或DNA变性。

蛋白酶抑制剂的作用

蛋白酶抑制剂的作用
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。
蛋白酶其一是防止蛋白酶原转化成有活性的蛋白酶，如胰蛋白酶抑制剂，又称抑肽酶，能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗休克治疗。在腹腔手术后，直接注入腹腔可预防肠黏连。
上海金畔生物科技有限公司是一家集产品研发、生产、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。蛋白酶抑制剂为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为T8031，胰蛋白酶抑制剂能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶及纤维蛋白溶解酶的活性；用于纤维蛋白溶解现象，是做蛋白测定中常用的抑制剂之一。

MTT法检测细胞活性步骤及原理

要知道MTT法检测细胞活性步骤首先要知道MTT是什么？MTTMTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT法检测细胞活性原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
MTT法检测细胞活性步骤
A.Hela细胞复苏
1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度至1×104个/mL，部分接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养，此后定期更换培养液，维持细胞正常活性。
B.MTT检测复苏细胞的细胞活性
Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块。
1.接种培养瓶同时，将其余部分接种于96孔细胞培养板，7组，每组5孔，每孔100μL,37℃培养箱静置培养；
2.培养24h后，向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT（5mg/mL）20uL，37℃培养箱内培育；
3.4h后终止培养，将孔内培养液小心吸出。每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。同时每行第一孔设置为调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；
C.细胞生长曲线制作
接B.2，B.3步骤，连续测量7天，根据测量结果绘制细胞生长曲线。
[横坐标生长时间，纵坐标吸光度值。]
D.探究某药物对于细胞活性的影响
1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱，加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；
2.设置空白对照组及5个不同药物梯度的实验组，分别加载96孔培养板内（5个梯度剂量按药物种类待定），每个剂量分别设置5个平行孔，每孔加入细胞悬液100μL（在加药的前一天下午完成铺板）；
3.次日上午按预先设置的药物梯度加药，后置37℃培养箱培养24h；
4.每孔加入20μLMTT溶液，继续培养4h（若药物能与MTT反应，可以先离心后弃去上清液，用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液）
5终止培养，小心吸去孔内培养液；
6.每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
E.Hela细胞冻存?
1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接细胞移至15ml离心管中；
3.离心1000rpm，5min；
4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5?ml；
6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/?min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10
℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h?，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

MTT法检测细胞活性其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT法检测细胞活性该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。