DEAE-Sephadex A-50纯化血清中的γ球蛋白

产品简介

DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85-7.5)，其余均属酸性蛋白。在PH7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex?A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。

产品参数

产品名称：DEAE-Sephadex A-50

货号：17-0180-02

基质：Sephadex

颗粒大小：40-120μm

最大流速：45cm/h

工作pH：2-9

操作温度：室温

保存条件：室温

实验步骤

1、预处理

称DEAE-SephadexA-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5M NaOH15ml的比例，将A-50浸泡于0.5MNaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5MHCl同上操作过程处理，最后以0.5M?NaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH7.4?PB中过夜。

2、装柱

(1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

(2)将0.1M，PH7.4?PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

3、平衡

启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4、加样及洗脱

启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2％，蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴／分钟。

5、收集

开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

6、测蛋白

以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

7、合并、浓缩

将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02％NaN３防腐剂，于4℃保存备用。

8、A-50凝胶的再生

在柱上先以2MNaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中４℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

(四)注意事项

1.柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

2.纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

3.所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

4.洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。

5.样的体积要小，浓度不宜过高。

6.加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

丙酮酸钠的应用

丙酮酸钠是糖酵解观察中的中间产物，是细胞代谢所需的营养成分，可以直接进出细胞。添加到培养液中即为细胞提供能量，又是合成代谢所需的碳源。

丙酮酸钠应用：

有些类型的细胞需要添加丙酮酸钠，降低血清浓度时也可添加，进行克隆培养时可添加。丙酮酸钠还有助于降低荧光物质引发的光毒作用。丙酮酸钠使用浓度通常是1mmol/L。

亚甲基蓝染色原理

亚甲基蓝是一种活体染色剂,是碱性染料,呈蓝色粉末状,能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度6%）.而染色体容易被碱性染料染色.

亚甲基蓝(Methylene blue)又称美蓝、次甲基蓝、次甲蓝等，是一种芳香杂环化合物。含水亚甲基蓝的分子式为C16H24ClN3O3S，分子量为373.9，CAS号为7220-79-3。亚甲基蓝可以结合核酸,使细胞核呈蓝色.所以用亚甲基蓝溶液染色后,被染为深蓝色的部分是（细胞核）。亚甲基蓝染色液常用于丝绸、纸张、细菌、细胞等染色。因其容易氧化，染色结果不宜长久保存。

上海金畔生物科技有限公司备有现货产品亚甲基蓝染色液，货号分别是G1301、G1302和G1303，三种的主要区别是染色液的浓度。根据不同是实验需要，用于相关的科研实验研究，在生化实验领域，一般用于细菌和细胞的染色。

关于四季青优级胎牛血清相关介绍

关于四季青无支原体优级胎牛血清相关介绍

无噬菌体、低内毒素

1）优级胎牛血清100ml

无噬菌体、低内毒素优级胎牛血清： 本品采自出生前胎牛，3次0.1um过滤。极佳的促细胞生长繁殖效果。细胞生长(快)曲线峰值，1.4×106细胞倍增时间(短) ，≤17小时细胞克隆率(高)，≥80％适合： 细胞株的保藏及组织器官培养、单抗研制。

2）特级胎牛血清100ml

无噬菌体、低内毒素特级胎牛血清： 本品采自出生前胎牛，3次0．1um过滤。极佳的促细胞生长繁殖效果。细胞生长(快)曲线峰值，1.6×106细胞倍增时间(短) ，≤16小时细胞克隆率(高) ，≥85％适合：细胞株的保藏及娇贵细胞株(如昆虫细胞、淋巴细胞)的培养。

3）超级新生牛血清500ml

4）超级新生牛血清200ml

无噬菌体、低内毒素超级新生牛血清： 本品采自出生后2小时内的新生牛，低1gG，3次0.1um过滤。内毒素含量极低(≤5EU/m1)， 超过国际先进水平。促细胞生长繁殖的三大指标超过国家标准。  细胞生长(快)曲线峰值　　1.2×106  细胞倍增时间

5）特级新生牛血清500ml

无噬菌体、低内毒素特级新生牛血清： 本品采自出生后14小时内的新生牛，3次0.1um过滤。各项质量指标均符合现行版《中华人民共和国药典》中对牛血清的有关要求。具有较好的促细胞生长繁殖效果。适合： 多种利用原代和传代细胞规模化培养的疫苗生产。

6）优级胎牛血清100ml

7）优级胎牛血清200ml

无噬菌体、低内毒素优级胎牛血清： 本品采自出生前胎牛，3次0.1um过滤。极佳的促细胞生长繁殖效果。细胞生长(快)曲线峰值，1.4×106细胞倍增时间(短)，≤17小时细胞克隆率(高)，≥80％适合： 细胞株的保藏及组织器官培养、单抗研制。

8）顶级新生牛血清200ml

无噬菌体、低内毒素顶级新生牛血清： 本品采自出生后0．5小时内的新生牛，即生即采，无污染。1gG极低，3次0．1um过滤。促细胞生长繁殖效果极佳， 可替代胎牛血清。细胞生长(快)曲线峰，1.3×106细胞倍增时间(短)，≤18小时细胞克隆率(高），≥75％适合： 细胞株的保藏及组织。

9）成年牛血清400ml

成年牛血清： 本品采自健康成年牛，2次0.22um过滤。适合：诊断试剂及标准品生产用。

无支原体

1）无支原体优级胎牛血清100ml

无支原体优级胎牛血清： 本品采自出生前胎牛，3次0.1um过滤。极佳的促细胞生长繁殖效果。细胞生长(快)曲线峰值，1.4×106细胞倍增时间(短），≤7小时细胞克隆率(高) 　　　　　≥80％适合：组织器官培养、单抗研制。

2)无支原体超级新生牛血清200ml

无支原体超级新生牛血清： 本品采自出生后2小时内的新生牛，低1gG，3次0.1um过滤。促细胞生长繁殖的三大指标优于国家标准。细胞生长曲线峰值,1.2×106细胞倍增时间　　　　　　 ≤19/小时细胞克隆率,≥70％适合：单抗研制、原代和传代细胞培养。

3)无支原体超级新生牛血清500ml

无支原体超级新生牛血清： 本品采自出生后2小时内的新生牛，低1gG，3次0.1um过滤。促细胞生长繁殖的三大指标优于国家标准。细胞生长曲线峰值,1.2×106细胞倍增时间　　　　　　 ≤19/小时细胞克隆率,≥70％适合：单抗研制、原代和传代细胞培养。

4）无支原体特级新生牛血清500ml

无支原体特级新生牛血清： 本品采自出生后14小时内的新生牛，3次0.1um过滤。具有较好的促细胞生长繁殖效果。适合： 多种利用原代和传代细胞规模化培养的兽用疫苗生产。

5）无支原体特级胎牛血清100ml

无支原体特级胎牛血清： 本品采自出生前胎牛，3次0.1um过滤。极佳的促细胞生长繁殖效果。细胞生长(快)曲线峰值，1.6×106细胞倍增时间(短)，≤16小时细胞克隆率(高)　　　　　 ≥85％适合： 娇贵细胞株(如昆虫细胞、淋巴细胞)的培养。

6）无支原体顶级新生牛血清200ml

无支原体顶级新生牛血清： 本品采自出生后0.5小时内的新生牛，即生即采， 无污染。IgG极低，3次0.1um过滤。促细胞生长繁殖效果极佳，可替代胎牛血清。细胞生长(快)曲线峰值，1.3×106 细胞倍增时间(短)，≤18小时细胞克隆率(高)，≥75％适合： 组织器官培养、单抗研。

7）无支原体山羊血清

无支原体山羊血清： 本品采自健康山羊，3次0.1um过滤。适合：科研或诊断试剂生产用。