鞭毛染色的方法及鞭毛染色试剂盒的使用方法

鞭毛（flagellum）是在某些细菌菌体上具有细长而弯曲的丝状物。细菌的鞭毛的长度常超过菌体若干倍，直径一般为10—20nm。在某些菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物，少则1-2根，多则可达数百根。这些丝状物称为鞭毛，是细菌的运动器官。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。

鞭毛染色原理

鞭毛是细菌的运动“器官”，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，染色前先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色（如碱性复红、硝酸银、结晶紫）。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸。

鞭毛染色方法

1.碱性复红法和副品红法：

1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。

2. 结晶紫法：

又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.

3. 维多利亚蓝B法：

1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。

4. 镀银染色法：

1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。

5、鞭毛的负染：

菌悬液，直接滴在铜网上，1－2分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷钨酸溶液，1分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。

6、银染法：

首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在35度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常 脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。

鞭毛染色注意事项：

1.鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。

2.取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。

3.取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。

4.培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。

5.鞭毛染色的成功与否，与玻片的洁净度有非常密切的关系。

6.每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果。

上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养、试剂盒、实验耗材等产品。鞭毛染色试剂盒为上海金畔生物科技有限公司的自产产品。该产品常用于检查细菌鞭毛的数量和位置和鞭毛成分的分析研究。详细说明请与客服联系：400-968-6088.

果胶酶的使用及提取方法

果胶酶是一种天然的复合多糖类高分子化学物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶，通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。由黑曲霉经发酵精制而成，适用于果汁榨取、浓缩过滤、果汁澄清、膜组织分离。在食品、医药和日用化学行业具有广泛的用途。
果胶酶的作用
果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。天然的果胶质在原果胶酶作用下,转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团,生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。
果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，根据其作用底物的不同。又可分为三类。其中两类（果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶）存在于高等植物和微生物中，还有一类（果胶裂解酶）存在于微生物，特别是某些感染植物的致病微生物中。
果胶酶的使用方法
一、提高压榨果汁产量 用量：每吨破碎果实加60-120克，在40-55℃搅拌30分钟后压榨可使细胞更易破碎，果汁粘度下降，容易过滤，产量增加。
二、果汁澄清 用量：每吨果汁加60-100克（山楂汁加200克）50℃放置1-2小时即可过滤，可提高滤速，检验：取20毫升清亮果汁于试管加热至70℃，立即冷却后在0℃放5小时，若无混浊即合格。
三、果酒澄清 用量：每吨果酒加30-50克远天34复合酶
远天34能使果酒中的蛋白质很快的凝集沉淀，能使多肽分解成可溶的小分子肽或氨基酸，使瓶酒长期保持澄清稳定，1%的酶液可先加入空罐中缓慢搅拌。
1、在加酒母时添加，参与发酵，能使酒泥加快沉淀，出酒率，总酸，酒精度有所提高，色泽宜人，发酵结束酒已清亮稳定。
2、在发酵后的酒中添加，放置1-3天过滤加快酒体清亮。
3、因夹带滤质如纤维等轻微悬浮物的酒，加入本品1天后过滤，即不再出现悬浮物。
4、其它使用 香菇多糖：每吨香菇加8公斤果胶酶，同时加入糖化酶10公斤。
中草药： 每吨干料加1-2公斤，同时加中性蛋白酶或木瓜酶0.5-1公斤。
莲子 蒜 柑桔去内衣，每吨用100-200克，酶液可反复使用。
将西瓜皮提取果胶技术的具体操作方法介绍如下：
1.蒸煮压榨.选用新鲜无毒无腐的西瓜皮,清洗除去泥土后放在蒸笼中,等上汽后蒸30-40分钟,以西瓜皮蒸透变软、有水析出并滴下为宜（以杀灭活细胞中的果胶酶）.然后将其放于包装袋内压榨,以除去组织细胞中的水分.
2.水解过滤.将榨干的原料放入耐腐蚀的容器中,加水3-4倍,加酸调至pH值2左右,加热煮沸,保持一定时间后用布袋压榨过滤并收集其滤液.再将滤渣加水2倍,重复水解过滤1次,合并两次的滤液.初次水解时,要认真掌握酸度、温度和时间的关系,酸度大,温度高则时间短,温度低,酸度小则时间长.
3.脱色浓缩.在滤液中加入0.3%-0.5%的活性炭,保持55-60℃,脱色30分钟后将其浓缩至原体积的3%左右.
4.醇制加工.先在浓缩液中加入90%的乙醇溶液,加入量为浓缩体积的1倍或稍多.加入后便可看到有果胶絮凝出,片刻后,将絮凝果胶装入细布袋,压榨液体并回收液体中的乙醇.再将榨出的果胶用95%的乙醇溶液洗涤（用量为果胶的1倍）.稍待片刻后榨去乙醇液.
5.粉碎包装.将固体果胶置于搪瓷盘中,在65-75℃下烘烤.烤至水分在8%左右,干燥后研磨粉碎并过60目筛.分批次化验后,按规定将不同等次的产品合理调配,然后用聚乙烯塑料袋定量密封包装。

上海金畔生物科技有限公司是一家集产品研发、生产、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。国产果胶酶为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为P8181。进口果胶酶货号为P8180。多用于生化研究、植物细胞杂交和花药培养、促进果胶水解为蔗糖和半乳糖醛酸。咨询详细信息科致电：400-968-6088

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B的使用方法及注意事项

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B产品简介

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B 是琼脂糖凝胶CL-4B的辛基衍生物，含有疏水性正辛基。具有较好的流速，在配基和骨架间的键很稳定，可反复在pH7.0、120°C热压消毒。纯化疏水性较弱的蛋白质或膜蛋白。

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B产品参数

产品名称：辛基-琼脂糖凝胶CL-4B(Octyl- Sepharose CL-4B)

货号：S9300

基质：4%琼脂糖凝胶

配基：正丁烷基n-Octyl

配基密度： 40μmol/mL

颗粒大小：45-165μm

最大流速：50cm/h

每毫升结合量：15-20mgHSA

操作温度：室温

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B使用方法

1.装柱

将所有的试剂和填料达到室温.配制初始缓冲液(平衡液)和缓冲液。

根据柱子大小取所需凝胶的量，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液=3:1比例）配成匀浆。

将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液体（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意不要使用气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2-3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

2.平衡

让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡缓冲液一般是高盐浓度的缓冲液，如：0.02-0.05mol/L的PBS加1-2.5mol/L(NH4)2SO4等。

3.上样

样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心、过滤后上柱；

一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡洗液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

介质对样品组分吸附的程度取决于样品的疏水性质、流动相的离子强度和温度。温度越大、盐浓度越高或样品组分疏水性越强，介质对组分吸附越牢。

4.洗脱

疏水介质可用减小盐浓度进行洗脱。加表面活性剂或者有机溶剂可加强洗脱。最常用的洗脱液是低盐浓度缓冲液，如：0.02-0.05mol/L的PBS

5.再生

一般用低盐浓度的缓冲液洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用。若有失活的蛋白或者脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗（CIP）除去。

6.在位清洗

对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2M  NaCl去除。

对沉淀蛋白、以疏水作用结合的蛋白或者脂类物质，可用1M  NaOH去除。

对强疏水性结合的蛋白、脂类等，可用4-10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡。

清洗完毕后，用至少3倍柱体积缓冲液平衡柱子。

7.去热源

用0.5M的氢氧化钠清洗柱子5-6小时或者用0.1M的氢氧化钠24小时。或用以下步骤去除：

（1）2倍柱体积的70%的乙醇；

（2） 2倍柱体积50Mm Tris-HcL Ph7.5

（3）1倍柱体积4M尿素

（4）3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1M  NaCl;

以上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。

8.消毒

用0.5-1.0 M NaOH 室温下洗8-10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。

辛基-琼脂糖凝胶CL-4B注意事项

（1）密封贮存于4°C-28°C（保存溶液为20%乙醇+0.1 M醋酸钠），通风、干燥的地方，不能冷冻。用过的柱子贮存于4°C（20%乙醇）。

（2）在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。

赤霉素的性质及使用方法

赤霉素又称“920”，由四环骨架衍生而得，常用作植物激素，能促进茎、叶的生长，提早抽苔开花，促进种子、块茎、块根发芽，刺激果实生长,增加结果率或形成无籽果实等。

赤霉素的性质：

熔点 ：227 °C

比旋光度：82.5 º (c=10, ethanol)

折射率：81 ° (C=2, MeOH)

储存条件 ：0-6°C

水溶解性：5 g/L (20 º C)

Merck ：14,4419

BRN ：54346

稳定性：Stable. Combustible. Incompatible with acids, strong oxidizing agents.

NIST化学物质信息：Gibberellic acid(77-06-5)

赤霉素的使用方法：

1、提高杂交稻产量，杂交稻在生产中存在着10公分左右的包颈，导致抽穗不完全，无法授粉，从而降低结实率，影响产量。对此，应用赤霉素能有效地解决这些问题，方法是每亩用赤霉素10—15克，分2—3次喷洒。第一次喷药为抽穗10%时，每亩用2—3克；第二次在次日喷，每亩用量为4—6克，第三次在第二次的次日或隔天喷，每亩用量为4—6克。 

2、促进蔬菜生长：许多蔬菜如芹菜、菠菜、荠菜、茼蒿等均可使用赤霉素，以促进营养体生长，增加产量以及提早收获。 

3、打破马铃薯休眠：用0.5—4ppm浓度赤霉素浸切块的薯块10—15分钟，休眠期短的品种浓度低些，休眠期长的品种浓度高些，浸泡后的种薯，捞出放在阴凉处晾干，切勿在阳光下暴晒，之后即可播种。从而可打破休眠，促进芽萌发，使出苗早而齐。 

4、促进草莓开花：保护地栽培草莓，于初蕾期喷10ppm赤霉素，每株5毫升，可避免休眠，促进开花结果。

D-山梨醇的作用

                                                                                                D-山梨醇的作用