Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶 货 号 #M0538L-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – 等温扩增和链置换

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Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L

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相关产品

WarmStart® RTx 反转录酶

特性

 最佳 DNA 等温扩增(LAMP)性能
 快速聚合
 反应条件灵活,比 Bst DNA 聚合酶具有更高的盐耐受力
 6 0 – 7 2℃ 之间具有最佳反应性能(WarmStart)
 用 dUTP 替换 dTTP 对其几乎无影响

 WarmStart DNA 聚合酶可以在室温下建立反应,防止非特异性扩增,提高反应效率  

Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L

概述

Bst 2.0 DNA 聚合酶是 Bacillus stearothermophilus DNA 聚合酶 I,大片段(Bst DNA 聚合酶,大片段)的同源物,并由电脑模拟设计完成。Bst 2.0 DNA 聚合酶具有 5´→3´ 的聚合酶活性和强链置换活性,但没有 5´→3´ 核酸外切酶活性。和野生型 Bst DNA 聚合酶,大片段相比,该酶可有效提高扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等。

Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶在等温聚合酶中是独有的。像“热启动”PCR 聚合酶一样,这种特性在低于最适反应温度下可以抑制酶活性。因此,实验操作可以在室温下进行,并可以消除非特异性反应产物,提高反应效率。

NEB 的 Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶利用了核酸适配体技术。适配体是一种经过广泛修饰的特定核苷酸,通过非共价键作用结合到聚合酶上,从而在非许可温度下抑制酶活性(<50℃)。另外,Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶不需要单独的激活步骤。

Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶可以消除在室温条件下建立反应时,产生的非特异性的扩增,而传统的 Bst DNA 聚合酶或同源物可以掺入非模板序列核苷酸。

Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶                  货   号                  #M0538L
Bst 2.0 WarmStart 的优势:无论刚建立反应(实线)或 25℃ 温育 2 小时后,都能使 LAMP 实验在相同的时间点迅速启动反应。没有 Bst 2.0 WarmStart 的保护,在室温条件下温育的 LAMP 实验结果不一致。Bst 2.0 WarmStart 让扩增结果更均一,可以室温和高通量建立反应。 

来源

来源于 E. coli 菌株,该菌株携带有诱导启动子,可表达 Bst 2.0 DNA 聚合酶蛋白。  

反应缓冲液

1X 等温扩增缓冲液

[20 mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃),50 mM KCl,10 mM (NH4)2S04,2 mM MgS04,0.1% Tween-20]。  

单位定义

1 单位指 65℃ 条件下反应 30 分钟,能使 25 nmol 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需的酶量。 

浓度

8,000 和 120,000 units/ml。  

热失活

80℃ 20 分钟。  

使用注意

Bst 2.0 DNA 聚合酶不具有 3´→5´ 核酸外切酶活性。Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶的反应温度可以为 60-72℃。Bst 2.0 DNA 聚合酶不能用于热循环测序或 PCR。  

WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG) 货 号 #M1708L-NEB酶试剂 New England Biolabs

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WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)                              收藏

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产品特点

 设计 LAMP 引物,请使用 NEB LAMP Primer Design Tool

·为环介导等温扩增(LAMP)提供便捷的一步法解决方案,可用于 DNA 或 RNA(RT-LAMP)样品
·预混液含热敏 UDG 和 dUTP,降低残留污染风险
·预混液具备完全缓冲力,可兼容不同样品类型,适用于多种检测方法
·温启动技术可在室温下抑制酶活性
·如需了解使用 RT-LAMP 进行 COVID-19 快速筛查,请点击 Learn more
 

产品描述

 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)为 LAMP/RT-LAMP 提供了便捷的一步法解决方案,适用于 DNA 或 RNA 样品。LAMP 和 RT-LAMP 是一种常用等温扩增技术,通过使用 LAMP 特异性引物(用户自备)和链置换 DNA 聚合酶进行靶标核酸的快速检测。该预混液是在优化后 LAMP 缓冲液中混入了 Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和 WarmStart RTx 反转录酶。Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和 WarmStart RTx 反转录酶均经过基因工程改造,提高了在 LAMP 和 RT-LAMP 反应中的性能。WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)具备完全缓冲力,可兼容不同样品类型,适用于多种检测方法,包括:浊度检测、实时荧光检测(使用 LAMP 荧光染料时)和终点可视化检测,例如:基于金属离子指示剂的变色检测(羟基萘酚蓝)

 
由于先前扩增的产物会无意中成为后续反应的底物造成污染,因此预混液中的 dUTP 和热敏 UDG 可有效降低残留污染风险。热敏 UDG 在温度>50℃时可完全失活,因此对反应没有影响。
 
图 1:WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)适用于多种检测方法
 
 WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M1708L
 
使用 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)(NEB #M1708)对 RNA 或 DNA 样品扩增,可通过多种实时(A)和终点(B)检测方法进行结果判定。这些检测方式包括荧光法、不基于 pH 的变色法(例如:羟基萘酚蓝)、浊度法或琼脂糖凝胶电泳。对于实时荧光检测,可使用包含 50X LAMP 荧光染料的试剂盒(NEB #E1708),在常规实时 PCR 仪器的 SYBR®/FAM 通道中进行监测。
 
图 2:LAMP/RT-LAMP 预混液和适用样品类型
 
 WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M1708L
NEB 基于 pH 变化的 WarmStart 变色LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含/不含 UDG)(NEB #M1804)(NEB# M1800)缓冲力低,因此可使用 pH 敏感染料进行可视化扩增检测。基于 pH 值改变而产生的颜色变化(如粉红变黄色)所需缓冲力要低,高缓冲力样品或酸性样品可能会影响颜色变化,因此,这种方法限制了检测样品的种类。WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含/不含 UDG)(NEB #M1708,NEB #E1708)(NEB #E1700)是完全缓冲的,可检测所有样品类型,适用于多种检测方法,包括荧光或其它变色染料(例如:羟基萘酚蓝)
 
图 3:WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)对人 DNA 和 RNA 靶标进行稳健检测
 

 WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M1708L
 

 使用 WarmStart 荧光 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(不含 dUTP/UDG)(NEB #M1700 试剂盒中的组分)和 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)(NEB #M1708)进行 RT-LAMP(RNA 靶标)或 LAMP(DNA 靶标)实验。反应加入 1X LAMP 引物和 1X LAMP 荧光染料后,分别加入三个数量级的 Jurkat RNA 或 Jurkat DNA (10 ng-0.1 ng)和无模板对照(NTC),每个样品做 4 个重复,形成 25 µl 反应体系,置于 96 孔板中 65℃孵育 40 分钟。使用实时热循环仪(Bio-Rad® CFX96)中的 SYBR/FAM 通道进行 15 秒一次的荧光检测。每个点代表荧光信号超过仪器阈值的时间。除了个别说明外,每个样品都检测到所有 4 个重复(注:如果各重复的检测时间相似,则检测点重叠)。总体而言,各样品检测结果显示:NEB #M1700 和 NEB #M1708 性能一致。无模板对照均无扩增。
 
图 4:WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)对人 DNA 和 RNA 靶标进行稳健检测
 
WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M1708L
通过手动或 TEMPEST® 自动化液体处理工作站(96 孔,25 µl 反应)建立针对于合成 SARS-CoV-2 RNA 样品的 LAMP 检测体系。检测样品为:阳性样品(人总 RNA 混入 5,000、500 或 50 拷贝的合成 SARS-CoV-2 RNA)或无模板对照(NTCs)。经 65℃ 孵育 40 分钟,使用 1X LAMP 荧光染料在实时荧光仪器(Bio-Rad CFX96)中的 SYBR/FAM 通道检测。结果显示:两种体系的检测时间和最低检出限(LOD)结果一致。
 
图 5:WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)兼容不基于 pH 的变色法(例如:羟基萘酚蓝)
 
WarmStart® 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M1708L
使用 WarmStart 通用 LAMP/RT-LAMP 2X 预混液(含 UDG)和针对 N 和 E 基因的混合引物对合成 SARS-CoV-2 RNA 进行扩增,使用 0.12 mM 羟基萘酚蓝作为变色金属指示剂。检测样品为:阳性样品(人总 RNA 混入 5,000、500 或 50 拷贝的合成 SARS-CoV-2 RNA)、阴性样本(人总 RNA)或无模板对照(NTCs),如图所示。反应体系(25 µl)经 65℃孵育 45 分钟后,进行肉眼检测。

A.所有阳性样品均显示阳性结果,包括在所有仅含 50 拷贝的低起始量样品(n = 20),颜色明显从紫色变为蓝色。

B.所有阴性样品均未出现颜色变化(n = 32)。
 

 

WarmStart® Nt.BstNBI 货 号 #R0725S-NEB酶试剂 New England Biolabs

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WarmStart® Nt.BstNBI            货   号                  #R0725S

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产品优势

l 是刻内切酶

l  WarmStart 技术可在低于40°C 条件下抑制酶活性

l  产生切刻的 DNA 分子,而不是切断的 DNA 分子

l  可在室温条件下建立反应,在链置换扩增(SDA)反应中表现极佳

l  限制性内切酶酶切位点:GAGTC(4/-5)

产品概述

WarmStart Nt.BstNBI,克隆自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stereothermophilus),是一种位点特异性切刻内切酶。配方中加入了能够可逆结合的适配体,在低于 40℃ 条件下抑制酶的切刻活性。WarmStart Nt.BstNBI 仅切割双链 DNA 底物上的一条链,在识别序列后第 4 个碱基的 3´ 端产生单链切刻。

 

重要说明

Nt.BstNBI催化在识别序列的 3′端产生一个单链切刻。WarmStart 功能实现是通过在配方中加入 DNA 适配体,在低于 40°C 条件下抑制酶活性。

 

图 1:WarmStart Nt.BstNBI 在 25 °C条件下检测不到活性

 WarmStart® Nt.BstNBI            货   号                  #R0725S

A) 对噬菌体 T7 DNA 的切刻活性。1 μg T7 噬菌体 DNA 与不同量的 WarmStart Nt.BstNBI(NEB #R0725)和 Nt.BstNBI(非 WarmStart, NEB #R0607)在 50 μl 的 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中,于 25°C 或 55°C 条件下孵育 1 小时。加入 8 units 的酶并进行 2 倍的系列梯度稀释。如“+”所表示,当温度设置在55°C 时,两种酶都显示完全活性;当温度限制在 25°C 时,WarmStart 版本酶无活性。

B) 对荧光标记的双链 DNA的切刻活性。将 2 pmol 含有 Nt.BstNBI 识别位点的 48 bp 长的双链 DNA 与不同量的 WarmStart Nt.BstNBI(NEB #R0725)和 Nt.BstNBI(非 WarmStart, NEB #R0607)在 20 μl 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中,分别于 25°C 或 55°C 条件下孵育 30 分钟。加入 10 units 的酶并进行 2 倍的系列梯度稀释。将反应在 20 mM EDTA、0.1% Tween 20 中淬灭,然后用水稀释至 FAM 标记的双链 DNA的终浓度为 1 nM。在Applied Biosystems 3730xl Genetic Analyzer (96 capillary array) 上通过毛细管电泳(CE)进行片段分析,产物百分比(% Product)代表产物峰面积除以 FAM 通道中所有峰的总面积。以产物百分比(% Product)为 Y 轴,切刻酶单位数的对数值为 X 轴作图,其中产物百分比(% Product)的平均值和标准差取自三次重复实验。
 

 结论:WarmStart 版本在 55°C 条件下与常规版本活性相当,而在 25°C 条件下未检测到活性

 
图 2: WarmStart Nt.BstNBI 的反应温度曲线
 WarmStart® Nt.BstNBI            货   号                  #R0725S
在不同温度(25°C 至 80°C,间隔 5°C)下检测 WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) 和 Nt.BstNBI (Non-WarmStart NEB #R0607) 对荧光标记的双链 DNA的切刻活性。在 20 μl 含 NEBuffer r3.1 的反应体系中,加入 0.125 units WarmStart 或非 WarmStart 的 Nt.BstNBI 和 100 nM 的双链 DNA(5’6-FAM 标记)的反应,分别于不同温度下孵育 30 分钟。以产物百分比(% Product)为 Y 轴,反应温度为 X 轴作图,其中产物百分比(% Product)的平均值和标准差取自三次重复实验。
结论:WarmStart Nt.BstNBI 在低于 40°C 条件下只有不到 10% 的活性,在低于 30°C 条件下检测不到活性,因此可以在室温下建立反应,避免发生不希望的底物切刻。
 

3: WarmStart Nt.BstNBI 能够在室温下建立反应,因此在 SDA 中表现极佳

 WarmStart® Nt.BstNBI            货   号                  #R0725S
使用 WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) 或 Nt.BstNBI ( 非 WarmStart,NEB #R0607),在 25°C 下孵育 30 分钟后(模拟室温条件建立反应),或在冰上建立反应后立即进行相同的链置换扩增 (SDA) 反应。反应体系中加入 25 μl 1X 等温扩增缓冲液 (NEB #B0537)、0.5 μl LAMP 荧光染料 (NEB #B1700)、0.4 mM dNTP (NEB #N0447)、10 ng 模板 DNA(HeLa 基因组 DNA,290 个拷贝)、每种引物各 0.5 mM,1 μl Bst 2.0 DNA 聚合酶 (NEB #M0537S) 和 1 μl WarmStart Nt.BstNBI 或 Nt.BstNBI,在 55°C 下进行等温扩增并监测荧光 45 分钟。测试样品和阴性对照中阳性信号出现的时间差异仅在冰上建立的反应(两种版本)或室温下 WarmStart 版本的反应中是可区分的。重复实验之间的差异很小。

结论:在检测基因组 DNA 中 hBRCA1 扩增子的 SDA 反应中,只有 WarmStart Nt.BstNBI 能够成功在室温下建立反应。