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基因敲入用长单链DNA制备 v2
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Clontech	632666	Guide-it™ Long ssDNA Production System v2	50 Rxns	￥6,647

Guide-it Long ssDNA Production System v2可以让您根据需求，制备长至5,000 nt的长单链DNA（ssDNA），作为修复模板用于多种基因组编辑技术的基因敲入实验。该试剂盒提供了一种简单且快速的方法，通过选择性消化正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），可以将任何序列的dsDNA PCR产物转化成为ssDNA。每个试剂盒可制备50条ssDNA模板。 尽管在利用同源定向修复（HDR）进行准确基因组编辑的应用中，单链DNA（ssDNA）修复模板展示出了优于双链DNA（dsDNA）模板的众多优势（Roth et al., 2018）。但由于制备难度和制备成本的原因，长单链DNA（long ssDNA）的应用受到了限制。Guide-it Long ssDNA Production System v2提供了一种高效经济的方法，可以根据自己的实验需求制备ssDNA，让所有研究人员都可以体验ssDNA模板的优势。
与dsDNA相比，使用ssDNA作为模板的优势：
· 显著减少了随机整合和脱靶整合，从而提高了基因编辑效率，降低了出现实验伪像的可能性 · 细胞毒性更低，让您收获到更多的编辑细胞 · 由于来自非整合模板的转基因表达微乎其微，因此更容易识别出正确编辑克隆
与原版本产品Guide-it Long ssDNA Production System（Code No. 632644）相比，优化了反应体系，进一步提高了链消化酶（Strandase）处理效率，即便是以往制备困难具有挑战性的dsDNA模板，也可以高效制备ssDNA。
■ 产品特点
· 根据需求制备500–5,000 nt ssDNA供体模板，用于基因敲入实验 · 操作流程简单快速，只需几个小时即可完成 · 与dsDNA模板相比，脱靶整合显著降低 · 细胞毒性更低，编辑后的细胞群细胞活力更高
■ 实验操作流程图
图1. 用于基因敲入实验的长单链DNA（long ssDNA）供体模板制备流程。首先，使用克隆、融合PCR或者其它方法制备dsDNA模板，dsDNA模板除了包含目的基因之外，还需要包含长度为300-600 bp的同源臂，该同源臂与目的插入位点左右两侧的相邻序列相同源。接着，只在一端使用磷酸化引物进行PCR扩增，制备两种不同的dsDNA PCR产物（分别作为正义链ssDNA和反义链ssDNA制备模板）。添加链消化酶A（Strandase Mix A），开始消化降解正义链或反义链。由于链消化酶A只消化降解5’端被磷酸化的DNA链，所以可以有选择性地降解正义链或反义链。然后，添加链消化酶B（Strandase Mix B）完成消化反应获得ssDNA。最后，纯化反应液，准备适用于后续基因敲入实验的ssDNA供体。请注意，如果正向引物被磷酸化，则生成的ssDNA将是反义链；反之，如果反向引物被磷酸化，最终产物将是正义链。建议制备正义链和反义链两种ssDNA，分别进行基因敲入实验。
■ 实验例
图2. Guide-it Long ssDNA Production System v2提升了挑战性模板的处理能力和长至5,000 nt单链DNA的制备能力。Guide-it Long ssDNA Production System v2可成功制备长度为500 nt至5,000 nt的ssDNA。凝胶图显示了不同长度的dsDNA底物（泳道1），经过酶消化和纯化后相对应的正义（SS）和反义（AS）ssDNA产物（泳道2）。每个ssDNA HDR模板均设计为靶向CCR5基因。
图3. Guide-it Long ssDNA Production System v2优化了ssDNA制备效率，可更有效处理具有挑战性的dsDNA模板。凝胶图显示了几种HDR模板的dsDNA起始材料（Lane 1）和正义（SS）或反义（AS）ssDNA产物，这些ssDNA分别使用了Guide-it Long ssDNA Production System原版本产品（v1）或升级版本产品（v2）进行制备（ Lane 2和Lane 3）。对于v1 Guide-it试剂盒，本实验例所包含的dsDNA模板，已被鉴定为具有挑战性的ssDNA制备底物，很难制备出高纯度ssDNA。以溴化乙锭为染色剂，采用琼脂糖凝胶电泳法分析dsDNA和ssDNA。ssDNA产物的分子量要比相应dsDNA底物的分子量小。在所有情况下，Guide-it Long ssDNA Production System v2制备的ssDNA条带比v1版本更清晰，表明消化更完全、更均匀。
■ 产品组份
Guide-it Long ssDNA Production System v2（Code No. 632666）
· Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2（Code No. 632667）*   PrimeSTAR Max Premix (2X) 625 μl × 4   Strandase Mix A 250 μl   Strandase A/B Buffer (10X) 250 μl   Strandase Mix B 50 μl   Digestion Enhancer (5X) 500 μl   RNase Free Water 1 ml × 5   2-kb Control Template (2 ng/μl) 50 μl   Control Primer Mix (16 μM) 50 μl · NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit (Code No. 740609.50) 50次 × 2 · Buffer NTC（Code No. 740654.100） 125 ml
* 本产品不单独出售。
■ 保存条件
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2 (Code No. 632667) －20℃ NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Code No. 740690.50) 室温 Buffer NTC（Code No. 740654.100） 室温
■ 关联资料
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上海金畔生物科技有限公司代理Takara Clontech酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

基因敲入用长单链DNA制备 v1
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Clontech	632644	Guide-it Long ssDNA Production System	25 Rxns	￥5,654
Clontech	632645	Guide-it Long ssDNA Strandase Kit	25 Rxns	￥4,159

基因敲入用长单链DNA制备

CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变（knockout），但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。 虽然单链DNA（ssDNA）修复模板展示出了优于双链DNA（dsDNA）模板的众多优势，但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性，因而限制了长单链DNA（long ssDNA）模板的应用。Guide-it Long ssDNA Strandase Kit可以很好地解决这个矛盾，可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸，应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），将其转化为单链DNA。该试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂（25对正义链和反义链）。

与dsDNA相比，使用ssDNA作为模板的优势：

· 显著降低了随机整合到基因组中的概率，从而提高了基因编辑效率 · ssDNA模板导入产生的细胞毒性反应低 · 不存在随机整合或者表达，提高了基因编辑效率 · 非整合模板中不表达，更容易识别发生正确基因编辑的细胞克隆

注意：Guide-it Long ssDNA Production System包含NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up kit，用于在基因编辑实验之前纯化strandase反应液。

■ Overview

· 制备长达5 kb的长单链DNA（ssDNA）供体模板 · 三步操作，快速，简便易用 · 不存在随机整合或者表达，从而提高了基因编辑效率 · 单链DNA供体模板产生的细胞毒性远低于双链DNA模板

■ 应用

· 制作基因敲入实验供体模板，DNA片段> 500 bp

■ 操作流程概要

图1. 同源定向修复（Homology Directed Repair）实验用长单链DNA（long ssDNA）供体模板制备步骤示意图。第一步，通过合适的方法（克隆，融合PCR等）制作dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。第二步，通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A，开始消化降解正义链或反义链（Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链）。第三步，添加Strandase Mix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。

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