CMC柱层析分离血红蛋白的方法及注意事项

    CMC(CM Cellulose, 羟甲基纤维素钠)是一种阳离子交换树脂，是被广泛应用的离子交换树脂。下面介绍一下用羟甲基纤维素柱层析分离血红蛋白的方法。

    一、离子交换树脂的预处理

    称取CMC交换树脂8g，加10~20倍的0.5M NaOH 和0.5M NaCL等量混合浸泡24小时，然后用蒸馏水多次洗涤，然后再用柱层析的起始缓冲液（0.01M Ph6.5~6.7 磷酸缓冲液）浸泡12小时，使离子交换树脂和缓冲液充分达到平衡。

    二、上柱和洗涤

    预处理后的树脂，用起始缓冲液调成糊状，缓缓注入长度为30厘米，直径为1厘米的玻璃层析柱上，待树脂完全沉淀后，将层析柱顶部封住，并连接50毫升注射针筒加压至树脂紧密为止。然后连接装有起始缓冲液的加液器，以38mL/h，的流速洗涤树脂过夜。

    三、加样和洗脱

    按常规方法制成5%的血红蛋白溶液，并用起始缓冲液透析过夜。用吸管将2mL处理过的血红蛋白液延柱壁加入，待血红蛋白液渗入到与树脂面相平时，用吸管注入血红蛋白液2mL，随即封住柱顶，并连接加液装置，进行洗脱，洗脱液的pH值呈线性梯度增加。

    调节洗脱液的流速为12mL/h，用收集器收集，每管3mL，在415nm波长下比色，测定各管溶液的光密度，并每隔10管测定一次pH值。

    四、离子交换树脂的再生

    层析完成后，从柱中取出树脂，0.5M NaOH 和0.5M NaCL等体积混合通过布氏漏斗洗虑3次，再用蒸馏水洗至中性，然后再用起始缓冲液平衡12小时，即可再次使用。

    注意事项：

    1.交换树脂必须预处理充分，上柱后须用起始缓冲液洗涤至415nm的光密度接近于0；

    2.起始缓冲液的pH及梯度洗脱的pH应根据不同样品进行适当调整；

    3.分析的样品可用静脉血直接制成氧合血红蛋白溶液，或者通过一氧化碳制成碳氧血红蛋白溶液。