细胞核提取的方法介绍

 一、单细胞核提取的方法

是一种单次密度梯度离心分离法.聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液,其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll）,分子量为40kD,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点.高浓度的Ficoll溶液粘性高,易使细胞聚集,故通常使用60g/L的低浓度溶液,密度为1.020,添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度.国外常用商品Isopaque或Hypaque,故又称Ficoll-Hypaque分层液,将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液.分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳,因为人的红细胞密度1.093粒细胞密度为1.092,单个核细胞在1.076～1.090之间.而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同,如小鼠为1.088,马为1.090.分离时先将分层液置试管底层,然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后,轻轻叠加在分层液上面,使两者形成一个清晰的界面.水平式离心后,离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带.红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底.血小板则因密度小而悬浮于血浆中,唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞递经洗涤高
心重悬.本法分离单个核细胞纯度可达95％,淋巴细胞约占90％～95％,细胞获得率可达80％以上,其高低与室温有关,超过25℃时会影响细胞获得率.

2.Percoll分层液法

这是一种连续密度梯度离心分离法.Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒,对细胞无毒性.利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理,将密度不等的细胞分离纯化.用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合,高速离心后,使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度,再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上,低速离心后,便得四个细胞层.表层为死细胞残片和血小板,底层为粒细胞和红细胞,中间有两层,上层富含单个核细胞(75％),下层富含淋巴细胞(98％).该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法,但操作流程较长,手续较多

.二、使用密度梯度离心法提取细胞核

操作步骤

1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；

(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；

(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；

(3)余下的沉淀物进行下一步骤。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

上海金畔生物科技有限公司是生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养基、实验耗材等产品。细胞核提取试剂盒为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为SN0020。细胞核提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的细胞核。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的细胞核的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，性能稳定。

多聚赖氨酸使用操作步骤及注意事项

 多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的微生物类食品防腐剂。它是由25～30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。在试验中多聚赖氨酸可用于培育皿用多聚赖氨酸包被。下面重点介绍多聚赖氨酸使用操作步骤及注意事项。

1.灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2.用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃

3.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。

4.在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

九、注意事项

1.每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。

2.用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

3.不要在用过的稀释液中加新的溶液。

4.释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5.用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

上海金畔生物科技有限公司提供10×多聚赖氨酸现货发售，欢迎选购。如果您在使用过程中发现问题，可以拨打上海金畔生物科技有限公司技术支持电话4009686088。上海金畔生物科技有限公司将为您提供技术支持。感谢您对上海金畔生物科技有限公司的支持。

酪蛋白的配制、作用及用途

酪蛋白是一种含磷钙的结合蛋白，对酸敏感，pH较低时会沉淀。酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，又称：干酪素、酪朊、乳酪素。这部分纯化酪蛋白几乎没有磷酸盐从起始物料。酪蛋白是牛奶中发现一种磷蛋白。这种蛋白质有大量的实验应用，包括使用作为阻断剂在化学，恢复从中提取的样品的酶的活性，并作为蛋白酶和激酶分析的底物。
酪蛋白的制备：
(1)新鲜牛奶脱脂，加酸(乳酸、乙酸、盐酸或硫酸)，将pH调至4.8，使干酪素微胶粒失去电荷而凝固沉淀。用这种方法得到的干酪素称为酸酪蛋白，加酸的种类不同得到的酸酪蛋白却几乎毫无区别。酸酪蛋白是白色至淡黄色粉末或颗粒，稍有奶臭和酸味。在水中只是溶胀，若加入氨、碱及其盐时，则可分散溶解于水中。可溶于强酸、二乙醇胺、吗啉、尿素、甲酰胺、热苯酚和土耳其红油。
(2)将牛奶与粗制凝乳酶作用，形成凝固沉淀物，称为粗制凝乳酶酪蛋白，呈白色粒状，几乎无味无臭，加热灼烧会产生特有的臭味。凝乳酶酪蛋白比酸酪蛋白的灰分含量高。
酪蛋白的用途：
酸酪蛋白主要用作涂料的基料，木、纸和布的粘合剂，食品用添加剂等。作为涂料的基料约占总消费的一半，具有优良的耐水性，在颜料中能很好地分散，提高涂料的均匀性。此外，因流动性好，易于涂装施工，粗制凝乳酶蛋白主要用于制造塑料钮扣。酪蛋白钮扣与其他树脂钮扣相比，染色性、加工性、色泽鲜艳性均好，质量在钮扣中居中上等。干酪素与消石灰、氟化钠、硫酸铜均匀混合，再配入煤油得到酪素胶，是航空工业和木材加工部门使用的一种胶合剂。干酪素也用于医药和生化试剂。
酪蛋白在食品工业中主要用作固体食品的营养强化剂,同时兼为食品加工过程中的增稠及乳化稳定剂,有时能作为黏结剂、填充剂和载体使用。酪蛋白在食品中尤其适用于干酪、冰淇淋(用量0.3%~0.7%)、肉类制品(如火腿、香肠,用量1%~3%)及水产肉糜制品；以5%添加量强化面包和饼干中的蛋白质；在蛋黄酱中用量为3%。因为酪蛋白是最完善的蛋白质，它还可与谷物制品配合，制成高蛋白谷物制品、老年食品、婴幼儿食品和糖尿病食品等。

上海金畔生物科技有限公司是一家集产品研发、生产、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。酪蛋白为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为C8200。咨询详情可致电：400-968-6088

单克隆抗体制备过程与原理（附实验视频）

 单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.KÖhler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。单克隆抗体制备过程有以下几个步骤，下面讲简要介绍。

1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。

(1)体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一、筛选出杂交瘤细胞;二、在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。

以上五个步骤简要概述了单克隆抗体制备过程。下面再介绍一下单克隆抗体的实验原理。要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

附实验视频：

茜素红染色步骤及部分试剂配制

茜素红是橙黄色或黄棕色粉末。常用于细胞染色。下面就详细介绍了茜素红染色步骤及部分生化试剂配制方法。

茜素红染色

1.培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，蒸馏水冲洗3次

2.0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)37度，30min，

0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)

1g Tris（1g左右Tris均可） 加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。

Cultured pulp cells in 24-muiltiplates were fixed in 10% formalin and incubated with 1% Alizarin Red S (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) solution for 10 min at RT for Alizarin Red S staining Dahl-McGec-Russell茜素红S法：

固定：10%缓冲的甲醛液避免用含钙的固定液。固定2小时

试剂配制：

1。茜素红S染色液配制：

茜素红S 1g    蒸馏水 90ml    1%氢氧化铵 10ml

此液PH值应在6.3左右，此溶液至少可保存1个月。

2。醋酸液：

醋酸 0.2~1ml    蒸馏水 100ml

3。淡绿液：

淡绿 0.2g

蒸馏水 100ml

染色方法：

1.切片脱蜡至水

2.入茜素红S液中 5 min

3.快速蒸馏水流

4.淡绿 20-30秒

5.醋酸液速洗

6.无水酒精快速脱水

7.二甲苯透明，中性树胶封固。

1、1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）

□组份浓度 1 M Tris-HCl

□配制量 1L

□配置方法 1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。

pH值 浓HCl

7.4 约70mL

上海金畔生物科技有限公司备有多种浓度、规格茜素红s染色液现货发售。欢迎选购。