NEB Golden Gate 组装混合液(停产有替代) 货 号 #E1600S-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – DNA修饰酶与克隆技术 – 克隆 & 合成生物学

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NEB Golden Gate 组装混合液(停产有替代)             货   号                  #E1600S

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停产通知

请注意:该产品已停产,库存售完为止,替代产品为 E1601。

特性

 无痕克隆 – 组装后无额外碱基存在
 可用于组装重复区
 兼容片段长度广(>15 kb 至 <100 bp)
 有效组装高 GC 区 

概述

Golden Gate 可高效、无痕的克隆组装 DNA片段。该方法起始于 1996 年,这是第一次使用IIS 型限制性内切酶和 T4 连接酶顺序或同时将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。这类核酸内切酶产生用户确定的唯一的末端序列,该内切酶在识别位点之外进行切割。产生的 DNA突出末端与临近可连接的互补 DNA 末端退火。一旦组装上,结构中内切酶的识别位点已经不存在。因为每一个互补可连接的 4 碱基突出端都是钝端(内切酶识别位点已经不存在),目的组装产物随时间逐渐积累。该方法特别适用于多重组装实验,例如 TALEs (Transcription Activator
Like Effectors)和 TALENs(TALEs fused to a FokI nucleasecatalytic domain)。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验。
 
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NEB Golden Gate 组装混合液包含

– NEB Golden Gate 组装混合液
– Golden Gate 反应缓冲液(10X) 

质保声明

NEB Golden Gate 组装混合液经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。更多信息请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。 

参考文献

关于该酶性质和产品应用的参考文献,请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。 

NEB Golden Gate 组装混合液(停产有替代)             货   号                  #E1600S

NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsaI-HF® v2) 货 号 #E1601L-NEB酶试剂 New England Biolabs

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NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsaI-HF® v2)                              收藏

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特性:

Ÿ   使用新酶 BsaI-HFv2(针对 Golden Gate 应用优化)

Ÿ   无缝克隆组装后无额外碱基存在

Ÿ   目的质粒含 T7/SP6 启动子

Ÿ   单次反应即可按顺序组装多个片段(2-20+

Ÿ   也可用于单个片段克隆和文库制备

Ÿ   有效组装高 GC 区和重复区

Ÿ   兼容片段长度广(<100 bp 至 >15kb

用于 Golden Gate 的 IIS 型限制性内切酶

 – BsaI (NEB #R0535)

– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)

– BbsI (NEB #R0539)

– BbsI-HF (NEB #R3539)

– BsmBI (NEB #R0580)

– Esp3I (NEB #R0734)

概述:

 NEB Golden Gate 组装试剂盒(BsaI-HFv2)内含优化的混合液。利用 Golden Gate 方法,混合液中的 BsaI-HFv2 T4 DNA 连接酶可以完成多个片段的组装。试剂盒自带目的质粒 pGGA,为组装提供骨架,同时为亚克隆提供限制性内切酶酶切位点,以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

 

Golden Gate 可高效、无痕地克隆组装 DNA片段。该方法起始于 1996 年,当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次或同时将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

 

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点,却在识别位点的下游特定位置进行切割,切割位点是位置特异的,而非序列特异的。这样,单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如,BsaI 的识别位点为 GGTCTCN1/N5),其中 GGTCTC 是识别和结合位点,而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后,下链的第五个碱基后。片段连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点,所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐积累。

 

该方法特别适用于多重组装实验,例如 TALEs (转录激活因子样效应物)和 TALENsTALES FokI 核酸酶催化结构域融合表达)。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验以及不同来源基因的文库构建。

 

连接酶保真度的研究进展:NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识,包括评价末端连接保真度的多种手段的开发,从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度。该研究使突出末端的选择更为慎重,这对于构建复杂 Golden Gate 组装产物尤为重要。更多详情请登陆 www.neb.com/goldengate

 

为加快实验进程,请登陆 GoldenGate.neb.com 使用设计软件。

Ligase Fidelity Viewer*

使 Golden Gate 突出末端连接组装设计变得可视化。*这是一个 NEBeta™ 软件,在设计和使用上还不够完善。欢迎分享您的使用反馈。使用该软件请登陆 www.neb.com/research/nebeta-tools

 NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsaI-HF® v2)            货   号                  #E1601L

NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2) 货 号 #E1602L-NEB酶试剂 New England Biolabs

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NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)                              收藏

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#E1602L
100 rxns
4,959.00

#E1602S
20 rxns
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特性

·试剂盒含 BsmBI-v2,经优化用于 Golden Gate 组装

· 无缝克隆 – 组装后无额外碱基
·单次反应实现多片段定向(2-20+)有序组装
·可用于单片段克隆和文库制备
·高效组装高 GC 含量或高重复序列
·兼容不同长度片段组装(< 100 bp 到 > 15 kb)
·试剂盒含目的质粒,克隆有 Golden Gate 组装常用的 IIS 内切酶位点
·登录 GoldenGate.neb.com 使用免费工具
 

概述

 NEB Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)是 BsmBI-v2 T4 DNA 连接酶的优化预混液。BsmBI-v2 NEB 公司研发的 BsmBI 的升级版本,在 Golden Gate 组装中的表现优于原酶。这些酶联合使用可完成多个插入片段/模块的组装,也可用于单插入片段克隆/文库构建。试剂盒提供 pGGAselect 目的质粒,作为组装骨架。该多功能目的质粒上定向克隆有 BsmBI-BsaI- BbsI- 的识别位点,使其能方便地与这三种在 Golden Gate 中最常用的 IIS 型限制性内切酶一起使用。该质粒还含有多个限制性内切酶识别位点,方便进行亚克隆,并具有 T7/SP6 启动子序列,供体外转录使用。

 

 起源于 1996 年的 Golden Gate 组装12技术可对 DNA 片段进行高效无缝组装,该技术利用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶的分步3或同步4作用,可将多个插入片段组装进载体骨架。

 

 IIS 型限制性内切酶与识别位点结合,却在识别位点下游的特定位置切割 DNA,切割位点是位置特异,而非序列特异。因此,单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如,BsmBI 的识别位点为 CGTCTC(N1/N5),其中 CGTCTC 是识别和结合位点,而 N1/N5 表示切割位点位于正义链的第一个碱基后,反义链的第五个碱基后。酶切片段间产生 4 个碱基的互补突出末端,发生退火进行连接。酶切后的片段及最终的组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点,所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐增多。

  

 该方法特别适用于多片段组装,例如 TALEs Transcription Activator Like Effectors,转录激活因子样效应物)5 TALENsTALEs FokI 核酸酶催化结构域融合表达)6Golden Gate 方法也适用于单片段克隆、构建不同来源的文库克隆来自不同来源的片段和涉及定向进化的多位点突变研究7

 

 请注意,虽然 Golden Gate 组装中常用到 BsmBI 内切酶,但 NEB 的试剂盒和操作步骤中则使用 BsmBI-v2,该酶是原酶经过改造和优化的升级版。

  

 观看视频教程,以了解更多 Golden Gate 组装的工作流程。

 

 1. 概述:使用 BsmBI-v2 进行 Golden Gate 组装操作

 NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)            货   号                  #E1602L

 

2. Golden Gate 工作流程

NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)            货   号                  #E1602L

简单来讲,Golden Gate 组装需要 IIS 内切酶的识别位点,在本示例中,需要在 dsDNA 片段的两端加上其识别位点(CGTCTC)。酶切后,识别位点被切除,组装片段末端带有设计好的特定 4 碱基突出以指导组装。

 

3. BsmBI-v2 进行高效和高保真 Golden Gate 组装

NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)            货   号                  #E1602L

遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤,在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以完成复杂组装,但 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 65 个循环的组装且背景低。(a)组装效率和(b)组装准确性(保真度)与循环数的关系如图所示。

 

4. BsmBI-v2 T4 DNA 连接酶进行复杂组装

NEB® Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)            货   号                  #E1602L

 

遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤,在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段,但延长循环数增加到  65 个循环。从 25 µl 组装反应中取 2 µl 进行转化和增菌培养后,取 1/10 体积的增菌培养物接种平板,1100 个菌落生长,菌落的保真度高达 96%,相当于每次组装反应产生 137,500 个菌落。该实验证明了酶混合液的稳定性,如果预期获得最大组装效率,循环数量可以超过标准的 30 个循环。 

NEB Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)包含:

– NEB® Golden Gate 酶预混液

– T4 DNA 连接酶反应缓冲液(10X

– pGGAselectII DNA

 

用于 Golden Gate IIS 型限制性内切酶

– BsaI (NEB #R0535)

– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)

– BbsI (NEB #R0539)

– BbsI-HF (NEB #R3539)

– BsmBI (NEB #R0580)

– BsmBI-v2 (NEB #R0739)

– Esp3I (NEB #R0734)

 

NEB Golden Gate 组装试剂盒(BsmBI-v2)包含:

– NEB® Golden Gate 酶预混液

– T4 DNA 连接酶反应缓冲液(10X

– pGGAselectII DNA

 

用于 Golden Gate IIS 型限制性内切酶

– BsaI (NEB #R0535)

– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)

– BbsI (NEB #R0539)

– BbsI-HF (NEB #R3539)

– BsmBI (NEB #R0580)

– BsmBI-v2 (NEB #R0739)

– Esp3I (NEB #R0734)

 

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质保声明

 NEB Golden Gate 组装混合液经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。更多信息请登陆 www.neb.com www.neb-china.com

参考文献

1. Engler, C. et al.(2008).PLoS ONE. 3, e3647.

2. Engler, C. et al.(2009).PLoS ONE. 4, e5553.
3. Lee, J.H. et al.(1996).Genetic Analysis: Biomolecular Engineering.13, 139–145.
4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A.(1996).Gene.168,31–35.
5. Weber, E. et al.(2011).PLoS ONE.6,e19722.
6. Christian, M. et al.(2010).Genetics.186,757–761.
7. Pullman, P. et al.(2019).Nature.9,10932.
8. Potapov, V. et al.(2018).ACS Synth. Biol. 7, 2665–2674.