简述bradford法测蛋白浓度实验过程

Bradford法测蛋白浓度是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。
Bradford法测蛋白浓度原理
考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，bradford法测蛋白浓度是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
Bradford法测蛋白浓度试验过程
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
3、标准曲线的制作
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0  0.1 0.2  0.3  0.4  0.5  0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1  0.9  0.8  0.7 0.6  0.5 ? 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：
1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
一、实验目的
用bradford法测蛋白浓度，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、bradford法测蛋白浓度实验过程
1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
BSA体积（ul） 100 80 60 40 20
PBS体积（ul） 900 920 940 960 980
BSA浓度（mg/ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液。
移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10?mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0?mg/ml）作对照试验。
用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。
bradford法测蛋白浓度实验结果
通过用Bradford法测蛋白浓度，得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。

tris饱和酚配制

 Tris饱和酚是用Tris-Cl pH8.0饱和过的重蒸酚，为浅黄色透明液体，有刺激性气味，上层为Tris盐酸缓冲液，pH>7.8。虽然现在有现成产品出售，但是还是要掌握tris饱和酚配制方法。下面就详细介绍配制步骤和方法。

Tris饱和酚：

1、冰箱取出重蒸酚，室温放置－－－68度水浴溶化，切勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂；

2、加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，（原液14. 4MOL/ML），混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行）；

3、加入等溶剂的1MOL/ML的Tris(PH8.0),反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层；

4、加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相；

5、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)平衡数次，至PH为8.0；

6、加0.1MOL/MLTris(PH8.0)于棕色瓶中4度保存；

7、如黄色消失或呈粉红色，则不能使用。

提醒各位老师和同学，Tris饱和酚为有毒、刺激性物体，需要在通风橱中操作。上海金畔生物科技有限公司提供成品出售。免去手动配制tris饱和酚。欢迎选购。

上海金畔生物科技有限公司LB肉汤的用途及注意事项

LB肉汤是一种培养基的名称，应用在微生物培养方面越来越广泛，常用于生化分子试验中，用该培养基来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用要求。培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。

LB肉汤贮存方法：

培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~10℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。

LB肉汤用途分类：

运送培养基：在取样后和实验室样品处理前保护和维持微生物活性的培养基。

保藏培养基：用于在一定期限性内保护和维持微生物活性，防止长期保存对微生物不利影响或使微生物长期保存后容易复苏的培养基，如菌种保存培养基等。

复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基，如蛋白胨水等。

增菌培养基：大多为液体培养基，为微生物提供特定的生长环境，如营养肉汤、TSB等。

选择性增菌培养基：能够保证特定微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其它微生物生长的培养基。

非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长的培养基，如胰酪大豆胨肉汤等。

选择性分离培养基：支持特定微生物生长，而部分或全部抑制其它微生物生长的培养基。

鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生理生化特征鉴定的培养基，如木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂、三糖铁琼脂培养基等。

鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认试验的培养基，如兔血浆、生化鉴定系统等。

多用途培养基：同时可归为多种不同用途的特定培养基，如血琼脂，可为一种复苏培养基，也可为分离培养基，也可为鉴别培养基(溶血试验)。

LB肉汤注意事项：

1、实验应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀释过后的标准品应丢弃，不可保存。

2、实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3、不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4、使用一次性的吸头以免交叉感染，吸取终止液和底物A,B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5、使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混合试剂盒盒里的各种成分及样品。

6、底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴漏于光下。避免用手接，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

7、加入试剂的顺序一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

8、按照说明书中标明的时间,加液的量及顺序进行温育操作。

上海金畔生物科技有限公司是生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养基、实验耗材等产品。LB肉汤为上海金畔生物科技有限公司的常备货产品，其货号为ML8280。该产品在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。

考马斯亮蓝染色步骤

 考马斯亮蓝染色法也称考马斯蓝法(coomassie blue staining)又称Bradford法。是测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。下面就着重介绍下考马斯亮蓝染色法原理。

考马斯亮蓝染色步骤：

1 电泳结束后，切取少量含有MARK蛋白以及少许样品的小部分凝 胶进行染色，其余部分用保鲜膜包好，放在4℃冰箱保存。 取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝 胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时 间。 注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚， 温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时 间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近， 在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4 个小 时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 

2 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3 次。 

3 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色 4-24 小时。期间更换脱色液2-4 次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染 色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2 小时后即可出现。 注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附 在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。 

4 完成脱色后，用ddH2O浸泡，至于未染色凝胶长度相等时，参照 MARK 蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。

8-羟基喹啉的生物学应用

8-羟基喹啉

英文名称： 8-Hydroxyquinoline

性状：8-羟基喹啉是一种白色或淡黄色结晶或结晶性粉末。不溶于水和乙醚，溶于乙醇、丙酮、氯仿、苯或稀酸，能升华。腐蚀性较小。

8-羟基喹啉的生物学应用：

（1）是核糖核酸酶的部分抑制剂，加入到含有苯酚的有机抽提缓冲液中，防止苯酚氧化生成苯醌,使用浓度通常为0.1%(1g/L)。8-羟基喹啉的加入使苯酚：氯仿呈亮黄色，有助于核酸分离纯化时区分有机相和水相。与VDR结合后8-羟基喹啉从亮黄色变成深绿色。如果抽提的有机苯酚黄色说明所有的VDR都已经除去。

（2）广泛用于金属的测定和分离。能与Cu+2、Mg+2、Ca+2、Sr+2、Ba+2、Zn+2、Cd+2、Al+3、Ga+3、In+3、Yt+3、La +3、Pb+2、Cr+3、Mn+2、Fe+3、Co+2、Ni+2、Pd+2等多种金属离子络合。

贮存条件：密封阴凉干燥保存；

急性毒性：有毒，小鼠腹腔半数致死量48mg/kg。

注意事项：8-羟基喹啉有毒，使用时要小心做好个体防护。