支原体检测方法介绍

支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。基因数量为480。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核糖体，原核细胞的细胞器只有核糖体）。培养支原体营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲支原体最适pH6.0～6.5。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。通常检测支原体是否被污染会用到以及几种方法。

分离培养法：

分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候。

如果你实在不想等这么久，或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果，你可以试一试DNA、PCR或酶学检测方法。不过需要注意的是，上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体，而且灵敏度也没有分离培养法高，所以最好结合使用两种方法以获得最可靠的检测结果。DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。

DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。

PCR法：

PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株，PCR法检测支原体只需几个小时，是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。

酶学检测和ELISA：

此外，也还存在一些其他支原体检测方法。例如酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养基、试剂盒、实验耗材等产品。支原体检测试剂盒是上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为CA1080。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰氏染色为阴性。上海金畔生物科技有限公司支原体检测试剂盒利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

秋水仙素的作用原理

秋水仙素（C22H25O6N）是1937年发现的，是从百合科植物秋水仙的种子和球茎中提取出来的一种植物碱，是诱变多倍体效果最好的药剂之一。那么秋水仙素的作用原理是什么呢？秋水仙素是白色或淡黄色的粉末或针状结晶，易溶于冷水、酒精和氯仿，难溶于热水、乙醚等，熔点155℃。一般多使用它的水溶液。实验表明，有效的诱变浓度是0.0006—1.6％，以0.2％的浓度诱变效果最好。此药有剧毒，在应用时要特别注意。 

秋水仙素的作用原理：当细胞进行分裂时，一方面能使染色体的着丝点延迟分裂，于是已复制的染色体两条单体分离，而着丝点仍连在一起，形成“X”形染色体图象（称为C-有丝分裂，即秋水仙效应有丝分裂）；另一方面是引起分裂中期的纺锤丝断裂，或抑制前期纺锤体的形成，结果到分裂后期染色体不能移向两极，而重组成一个双倍性的细胞核。这时候，细胞加大而不分裂，或者分裂成一个无细胞核的子细胞和一个有双倍性细胞核的子细胞。经过一个时期以后，这种染色体数目加倍了的细胞再分裂增长时，就构成了双倍性的细胞和组织。 

秋水仙素不论是破坏还是抑制纺锤体的形成，作用都是一时的。秋水仙素可以抑制纺锤体的形成，导致细胞不分裂，——然后过一段时间秋水仙素代谢掉，不再起作用，细胞继续分裂，——然后才是“染色体数目加倍”（着丝点的分裂）。着丝点的分离与纺锤体无关，因为在用秋水仙素处理，破坏微管的情况下，两条单体也可以分开。这是由于Ca离子的诱导，使着丝点分开后，再由纺锤体牵引移向两极，也就是说纺锤体只起牵引染色体的作用。 

秋水仙素之所以造成两个方面的应用，是在于他们在利用时，秋水仙浓度的不同。用于中期核型分析的浓度较高 而用于产生双倍体或多倍体时浓度较低，并且当秋水仙素浓度很低时，还有加快染色体运动，使染色体更快的到达两极！ 

简述瑞氏-姬姆萨染色液的步骤

瑞氏-姬姆萨染色液是利用Romanowsky??Stain?技术原理改良而成的。主要应用于血液和骨髓涂片染色。姬姆萨染色液对胞浆着色力较强，能较好的显示胞浆的嗜碱性程度，着色清晰，色泽纯正，但是对胞核着色偏深,核结构显示较差。
瑞氏-姬姆萨染色液原理
瑞氏-姬姆萨染色液主要应用于血液和骨髓涂片染色，它是利用Romanowsky??Stain?技术原理改良而成的。细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对瑞氏-姬姆萨染色液中的酸性染料（曙红）和碱性染料（亚甲蓝）的亲和力也不一样。因此，标本涂片经瑞氏-姬姆萨染色液染色后，相应各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。
使用方法：
本产品可作为多种组织或细胞的染色使用，不同组织、细胞，不同的用途可以有不同的使用方法。具体方法请根据自己需求参考既有文献，本产品以涂片为例，举例说明，仅供参考。
1、取涂片、自然干燥。
2、滴加瑞氏-姬姆萨染液2-3滴覆盖整个标本涂片，染1-2分钟。
3、滴加等量的0.01M磷酸氢二钠溶液，轻轻晃动玻片, 与瑞氏-姬姆萨染色液充分混匀，染色3-5分钟。
4、水洗、吸干、镜检。
5、染色后胞浆和胞核的染色清晰分明，细胞核着色呈深浅不同的紫红色，胞浆呈浅红色，胞浆中颗粒区分明显。
注意事项：
1、涂片厚薄适宜，涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。
2、所加染液不能过少，以免蒸发而使染料沉淀。冲洗时间不能过久，以防脱色。
3、染色对pH十分敏感，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应接近中性，否则可能会导致细胞染色异常，形态难以识别，甚至错误。
4、 染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。

瑞氏-姬姆萨染色液是由碱性染料美蓝（ Methvlem blue ）和酸性染料黄色伊红（ Eostm Y ）合称伊红美蓝 染料即瑞氏（美蓝－伊红Y）染料。伊红钠盐的有色部分为阴离子，无色部分为阳离子，其有色部分为酸性，故称伊红为酸性染料。美蓝通常为氯盐是碱性的，美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐，其有色部分为阳离子，无色部分为阴离子，恰与伊红钠盐相反。

HE染色液配制方法介绍

苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。HE染色液易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。HE染色法作为石蜡切片最常用的反色法之一，其HE染色液配制方法其实也并不难。

HE染色液配制：

1．Harris氏苏木素（1990）

苏木素 2.5g

无水酒精 25ml

硫酸铝钾（钾明矾）50g

蒸馏水 00ml

黄*色氧化汞 1.25g

冰醋酸 20ml

配制时，先将苏木素溶于酒精（平时也可将苏木素以10%的浓度溶解好，贮存备用），取一2000ml的烧杯，倾入钾明矾，加入蒸馏水，于电炉上加热，熔解钾明矾，完全熔解后，待温度至90℃左右时，加入预先溶解好的酒精苏木素，继续加热至沸腾，延续3-5min，此时溶液逐渐加深，变为紫红色，拔离电源，加入黄*色氧化汞，当充分氧化后，重新插上电源继续加热3-5min，此时溶液变深紫色，拔去电源，直接将烧杯插入预先备好的冰水里，放于暗处，第二天过滤后加入冰醋酸，即可使用三个月，但据我们的实践及多年的经验认为，只要掌握好切片的“无水化”，该染液可反复使用达一年之久（天天使用）。

注意事项：

①苏木素一定要预先溶解，否则较难彻底溶解。

②加入黄*色氧化汞后，可产生大量的气泡，因此，配制500ml的溶液，一定要选择2000ml以上的容器，否则液体便会溢出。

③当溶液变为深紫色后，应终止氧化，烧杯应直接插入冰水中，不要担心玻璃瓶会爆裂，因烧杯经特殊处理的，不会有爆裂的危险，如果有，那是属于产品质量问题。迅速冷却的主要目的是不让溶液过度氧化，以免缩短溶液的使用寿命。

④溶液过滤后方加入冰醋酸，不要颠倒过来。如果加入冰醋酸后再过滤，过滤速度将非常慢，这是因为醋酸会使滤纸中的纤维膨胀，增加了密度，使溶液不易通过，导致过滤时间延长。

⑤该苏木素在使用一段时间后，可以在表面产生金属膜。当出现这种现象时，可用粗滤纸捞去，否则贴于切片上将较难除去。

⑥苏木素加入冰醋酸后，其PH值在2－2.28之间。

2.伊红 1g

75%酒精 100ml

先将伊红用蒸馏水(少许)调成浆糊状，再加入酒精，边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，取少许冰醋酸，加入到试剂中去，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色，染出切片，效果很好。3.1%盐酸酒精:99份无水酒精加上1份浓盐酸

上海金畔生物科技有限公司是一家集产品研发、生产、销售、服务于一体的高科技生物企业。产品主要涵盖生化试剂、分子生物学试剂、细胞培养、免疫学产品及实验耗材等。HE染色试剂盒为上海金畔生物科技有限公司自产产品，其货号为G1120，在细胞HE染色的组织切片中，细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色，二者形成鲜明的对比，易于观察分析。

微生物培养基的分类常见的微生物培养基有哪些

    微生物培养基是按照微生物生长繁殖或产生代谢产物所需要的各种营养物质，人工配制而成的营养基质。在微生物培养过程中，微生物培养基要根据不同的菌种及其不同的培养目的确定搭配的营养成分及营养比例。那么微生物培养基的分类是怎么样的呢？

微生物培养基的分类

    1、按照培养基用途分为培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。

    合成培养基：

    合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。

    按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。

    天然培养基：

    由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。

    半合成培养基：

    在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。

    2、按照培养基的物理状态分 培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。

    固体培养基：

    是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。用于微生物分离，鉴定，计数。如图，微生物分离成菌落、菌苔。图中为大肠杆菌菌落，是用涂布平板法得到。

    半固体培养基：

    是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。用于观察微生物运动特征。如图，左侧试管中微生物不运动，而右侧试管中微生物运动，因而两试管中现象不同。

    液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。用于观察微生物生长状态。

    3、按照微生物的种类分 培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类

    常见的微生物培养基

    营养琼脂（普通琼脂）:

    成份：牛肉浸液（或其它浸液,消化液或肉膏汤） 100毫升 琼脂（视天气,琼脂质量而定）。

    制法：将上物加热溶解,补足水,调ph至7．6,过滤分装121℃,高压灭菌15分钟.

    用途：作普通琼脂平皿.

    血琼脂平板（BA）：

    制法：取营养琼脂（PH7．6）,加热使其溶解待冷至45-50℃,以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀,立即倾注于平板或分装试管,制成斜面备用。

    用途：1． 一般棉拭子均接种此培养基.2．尿液,脓液 3．分离细菌标本用.

    基础培养基 （肉膏汤BB）：

    成份：蛋白胨 10克 牛肉膏 5克 氯化钠 5克 水 1000毫升

    制法：将以上各物称好,加水煮沸溶解,用1NNOH校正PH至7．6,过滤分瓶,121℃高压灭菌,20分钟备用。

    用途：1 作耐药试验,增菌用分装小管.2 作普通琼脂斜面.

    血液培养基（大管肉汤培养基）：

    成份：1 新鲜牛肉浸液 1000毫升 2 PABA（对氨基苯甲酸〔相当于10mg/毫升〕） 1g% 1毫升 3 MgSO4 [相当于0．493/100毫升] 49．3% 1毫升 4 枸椽酸钠 0．3g 

    制法：1 将1号,4号混合液,2号,3号液分装高压灭菌.2 取灭菌1,4号混合液用无菌法加入PABA,MgSO4,再分管,行无菌试验三天方可使用.

    用途：作血,骨髓培养用.