培养基的配制与灭菌方法说明
培养基（Medium）是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有水、氮源、无机盐（包括微量元素）、碳源、生长因子（维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。有些微生物，如自养型微生物，不需要碳源，所以上述物质只具有一般性。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，均改制成粉末。
培养基的配制
1.配料
配方换算→在容器中加入少量水（蒸馏水，自然水）→按照配方称取各种药品（依次加入）→加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。
2.溶解
淀粉溶解：少量冷水调成糊状加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃ ，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。
3.调PH
用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。
4.过滤
滤纸或棉花进行过滤。（有时可以省去）
5.分装
一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。
(1)三角瓶
若作静置培养，则100ml培养基/250ml的三角瓶，最多不能超过150ml培养基/250ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20ml培养基/250ml的三角瓶，保证通气良好。
(2)试管分装
液体培养基一般装4-5ml，约试管的1/4高度；固体斜面培养基一般装3-4ml，约试管的1/5高度。
6.包扎
分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。
7.灭菌
按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。
8.摆斜面
灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。
9.贮存
培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用。
培养基的灭菌
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
湿热灭菌有煮沸消毒法和高压蒸汽灭菌法两种，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。
高压蒸汽灭菌法是高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
培养基注意事项
1、确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。
2、其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。
3、另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。
苏木素染色原理是什么-技术文章
苏木素染色原理是什么
苏木素是一种碱性染料，同媒染剂（常用的是三价的铁或铝的盐）一起使用，能够使细胞核染色。苏木素和氧化苏木素都没有染色能力，但与媒染剂结合形成色淀（lake），这种色淀具有染色能力。核、染色体、着丝粒、中心体、线粒体、髓鞘等可被染成蓝色以至黑色。与伊红合用的苏木素-伊红双重染色法是最基本的一般组织的染色法，苏木素染色原理如下：
苏木素和伊红在组织学上被经常使用，碘液不同，这是一种永久染色街。其他常用的含有苏木素的染色剂有磷钨酸苏木素染色剂，也就是磷钨酸与苏木素的混合物。苏木素染色剂经常为组织的研究使用。明矾和三价铁盐常常被用作媒染剂，展示核和细胞质结构。这些媒染剂的原理都是形成媒染剂－染料－组织复合体，从而显示颜色。
苏木素染色内质呈淡蓝黑色，外质收缩，剩下部分不着色或色泽更浅。圆形细胞核呈蓝黑色。居中的核仁呈黑色小圆点。核膜较薄，其内侧缘均匀，整齐地排列着一层细小的染色质粒。核仁与核膜之间可见到核网。被吞噬的红细胞呈蓝黑色采用苏木素染色液进行免疫染色后的复染，操作步骤简便，操作时间短。可以操作步骤简便，操作时间短或培养细胞的染色，或与免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、原位杂交等配合使用。使用苏木素染色液染色后还可以进行免疫染色或其它染料的复染。苏
苏木素染色原理很简单，苏木素染色法也是常用的一种染色方法。木素染色后的细胞核呈现蓝色，细胞浆呈现粉红色或红色。染色液也可以重复使用，直至认为效果不佳时再换用新的染色液。
DSS诱导小鼠实验性肠炎建模参考文献
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简单介绍
探讨硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulphate，DSS)诱导的小鼠肠炎模型病变结肠组织的谷胱甘肽(GSH)变化及其与病变组织分泌的Th1/Th2型细胞因子IFN-g,IL-4及黏膜损伤的关系
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GSH在DSS诱导的小鼠实验性肠炎中的作用
张 静, 韩 英, 纪 欣, 王志红, 李虹义, 郑 力
张静, 中国人民解放军总医院军医进修学院 北京市 100853
韩英, 纪欣, 王志红, 李虹义, 郑力, 北京军区总医院消化内科 北京市 100700
张静, 女, 1973-05-02生, 河北保定人, 汉族. 1997年承德医学院本科毕业, 解放军总医院军医进修学院2002级硕士研究生, 主治医师, 主要从事炎症性肠病的发病及免疫机制等方面的研究.
北京市自然科学基金资助项目, No. 7042064
通讯作者: 韩英, 100853, 北京市东城区南门仓5号, 北京军区总医院消化内科.
电话: 010-66721009
收稿日期: 2005-04-11 接受日期: 2005-04-27
Roles of Glutathione in dextran sodium sulphate-induced colitis in mice
Jing Zhang, Ying Han, Xin Ji, Zhi-Hong Wang, Hong-Yi Li, Li Zheng
Jing Zhang, Postgraduate Medical School, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China
Ying Han, Xin Ji, Zhi-Hong Wang, Hong-Yi Li, Li Zheng, Department of Gastroenterology, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China
Supported by the Natural Science Foundation of Beijing, China, No.7042064
Correspondence to: Dr. Ying Han, Department of Gastroenterology, General Hospital of Beijing Military Command, 5 Nanmencang, East District, Beijing 100700, China.
Received: 2005-04-11 Accepted: 2005-04-27
Abstract
AIM: To investigate the expression of glutathione (GSH) in dextran sodium sulphate(DSS)-induced colitic mucosa and its relationship with cytokine secretion as well as mucosal injury.
METHODS: BALB/c mice in DSS group (n = 10) were fed with 50 g/L DSS to induce experimental colitis and those in normal controls (n = 10) were fed with distilled water. All the mice were killed after 7 days. The pathological changes of the colonic tissues were examined while immunohi-stochemstry was performed with GSH1 antibody to determine the GSH expression. ELISA was used to detect the expression of IL-4 and IFN-g.
RESULTS: The manifestations of acute colitis such as weight decrease, diarrhea and bloody stool appeared in mice of DSS group. focal crypt lesionsPathologically, focal crypt distortion, granulocyte and macrophage invasion were observed. The level of GSH in DSS group was significantly lower than that in control group (20.6 vs 3.14±1.0, t = 3.95, P = 0.01), whereas the expression of IL-4 was marked higher (38.7±4.7 vs 28.7±6.7, t = 3.16, P = 0.009). The content of IFN-g was decreased in DSS group (P>0.05).
CONCLUSION: Low expression of GSH is related to the increase of IL-4, decrease of IFN-g and mucosal injury in DSS-induced colitis in mice.
Key Words: Glutathione; Dextran sodium sulphate; Colitis; Mice; IL-4; IFN-g; Mucosal injury
Zhang J, Han Y, Ji X, Wang ZH, Li HY, Zheng L. Roles of Glutathione in dextran sodium sulphate-induced colitis in mice. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(12):1400-1403
摘要
目的: 探讨硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulphate，DSS)诱导的小鼠肠炎模型病变结肠组织的谷胱甘肽(GSH)变化及其与病变组织分泌的Th1/Th2型细胞因子IFN-g,IL-4及黏膜损伤的关系.
方法: 实验组小鼠(n = 10)给予含50 g/L DSS的蒸馏水自由饮用7 d之后处死，分离出的病变结肠一部分评价其病理学改变并用GSH1抗体做免疫组化，另一部分结肠培养后检测其IL-4、IFN-g的表达.对照组小鼠(n = 10)给予蒸馏水自由饮用7 d之后处死.
结果: DSS诱导实验性肠炎小鼠口服50 g/L的DSS溶液7 d出现体重减轻、腹泻、血便等急性肠炎的表现.病理学切片HE染色发现小鼠病变结肠腺体结构紊乱，黏膜和黏膜下单核细胞和多核细胞浸润.DSS组病变肠段组织GSH表达较对照组明显减少(2±0.6 vs 3.14±1.0，t = 3.95, P = 0.01<0.05)，病变结肠分泌的IL-4明显升高(38.7±4.7 vs 28.7±6.7，t = 3.16, P = 0.009<0.01)， IFN-g轻度降低(P>0.05).
结论: DSS诱导的实验性肠炎小鼠病变结肠组织GSH的减少与病变结肠组织分泌的细胞因子IL-4增加、IFN-g下降以及黏膜损伤相关.
关键词: 谷胱甘肽; 硫酸葡聚糖钠; 肠炎; 小鼠; IL-4; IFN-g;黏膜损伤
张静, 韩英, 纪欣, 王志红, 李虹义, 郑力. GSH在DSS诱导的小鼠实验性肠炎中的作用. 世界华人消化杂志 2005;13(12):1400-1403
http://www.wjgnet.com/1009-3079/13/1400.asp
0 引言
炎症性肠病炎(inflammatory bowel disease，IBD)是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，包括了两种独立的疾病，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD).虽然IBD的发病机制尚不清楚，目前发现其病因学机制与免疫异常、遗传影响、以及环境因素有关.近年来的研究发现，反应性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生过量对IBD的发展起着重要的作用.胃肠道黏膜自身有一些抗氧化防御系统，可以通过中和连续生成的ROS抵消其损害的影响.在这些防御网络中，内生硫氢基团，主要是还原型谷胱甘肽(GSH)，在一些动物模型中对胃肠道黏膜细胞保护抵抗氧化应激起着重要的作用[1-2].以往对抗氧化剂作用的大量研究中，已经报道了在IBD患者和实验性肠炎中包括GSH在内的抗氧化剂水平的降低[3-4]，而对于DSS诱导的实验性肠炎病变组织GSH的变化及其与黏膜损伤及细胞因子分泌的关系尚不明确，本实验将对上述问题进行研究和分析.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性BALB/c小鼠，5-6周龄，质量18-22 g;DSS(Sodium Dextran Sulfate 5000，Wako Pure Chemical Industries Ltd.大阪，日本和光纯药工业株式会社);HBSS(Hank’s balanced salt solution，Sigma公司);无酚红、无抗生素的RPMI 1640(HyClone，公司);complete medium RPMI 1640(Cambrex公司);LPS(脂多糖，Sigma公司);DTT(1，4-Dithiothretol，二硫基苏糖醇，Sigma公司);胎牛血清FBS(中国杭州江滨生物技术有限公司);小鼠IL-4、IFN-g检测试剂盒(Sigma公司);GSH1:山羊GSH抗体(Santa Cruz公司，sc-15087);山羊SP试剂盒(北京中杉生物试剂公司).
1.2 方法 取10只BALB/c小鼠，将DSS加入蒸馏水中配成50 g/L的DSS溶液，给小鼠自由饮用7 d，8 d处死.正常对照组小鼠10只给予蒸馏水自由饮用7 d，8 d处死.各组小鼠处死后，先将整段结肠取下，测量结肠长度，肉眼观察结肠的形态，充血、溃疡、糜烂程度和范围，计算质量减少率.取充血、糜烂最明显部位的肠段(环状、片状各1块，正常组取回盲部及近肛门部组织环状、片状各1块)于中性甲醛溶液小瓶送检病理.便血评分:便血评分将取病理后的肠段纵行切开，其血性内容物用0-3+标准评价:0:无出血，1+:结肠1/3出血，2+:结肠2/3出血，3+:整个结肠均有出血.肠道标本积分:炎症细胞的渗出评分标准:0分-黏膜固有层内有极少量炎症细胞，1分-黏膜固有层内有较多的炎症细胞或黏膜固有层内的炎症细胞增多，2分-炎症细胞扩散至黏膜下层，3分-全层均有炎症细胞渗出;组织损伤评分标准:0分-没有黏膜损坏，1分-不连续的淋巴上皮损坏，2分-表层黏膜糜烂，3分-广泛的黏膜破损并向肠壁深层结构扩展[5].
1.2.1 病变组织GSH的表达 应用山羊GSH1抗对病变组织切片进行免疫组化分析，并根据阳性强度及阳性率评分的半定量标准.阳性强度评分标准:0分:(-)，1分:(＋)，2分:(＋＋)，3分(＋＋＋).阳性率评分标准:0分:<10%，1分:10-25%，2分:26-50%，3分:>50%.总分为0-6分.
1.2.2 病变组织产生细胞因子的测定 将肠道病变组织标本置于含10 mmol/L DTT的HBSS中静置15 min，而后用RPMI1640液清洗肠段2次以除去DTT，在六孔培养板中加入含100 mL/L FBS 1 mL的RPMI1640共2 mL，置于CO2孵育箱内培养24 h，然后收集池内培养液，分装在3个eppindofe管中，-30℃冻存.应用小鼠IL-4，IFN-g检测试剂盒(ELISA法)测定IL-4，IFN-g.
统计学处理 应用STATA 7.0软件进行统计学处理，先用F检验，验证方差齐性，再进行t检验，P<0.05为差异有显著性.
2 结果
2.1 临床症状及病理学评价 BALB/c小鼠口服50 g/L的DSS溶液7 d成功诱导出急性肠炎，表现为体重减轻、腹泻、血便等.病理学切片HE染色发现小鼠左半结肠较右半结肠为重，结肠腺体结构紊乱，黏膜及黏膜下单核细胞和多核细胞浸润等.质量:DSS组小鼠体重下降而正常对照组体重增加(-0.7±0.8 g vs 2.4±0.9 g，t = -7.47，P = 0<0.001).血便:正常对照组小鼠结肠处死后结肠切开未发现血便，而DSS诱导组6只小鼠结肠发现血便(0.7±0.5 vs 0，t = 4.42，P = 0.003<0.001).结肠缩短:DSS诱导肠炎组小鼠与正常对照组小鼠比较，结肠有明显的充血，水肿，溃疡形成及长度缩短(9.2±0.6 vs 10.4±0.8，t = -3.72，P = 0.0 017 <0.01).病理评分:结肠病理切片HE染色发现，DSS诱导的实验性肠炎组小鼠的结肠局部腺体结构紊乱，黏膜及黏膜下中性粒细胞及单核细胞和多核细胞等炎性细胞浸润，黏膜局部糜烂，部分隐窝破坏，而对照组小鼠未发现上述变化(3.0±0.5 vs 0.4±0.7，t = -8.18，P = 0<0.001，图1).
2.2 小鼠结肠病变组织GSH表达 应用山羊GSH1抗对病变组织切片进行免疫组化分析，发现GSH主要表达在黏膜表面及腺体细胞的胞质内.通过半定量标准评分，发现DSS诱导实验性肠炎小鼠的病变肠段组织GSH表达明显低于对照组 (2±0.6 vs 3.14±1.0，t = 3.95，P = 0.01<0.05，图2).
2.3 小鼠病变结肠分泌的IFN-g及IL-4 DSS组病变肠段分泌的Th2细胞因子IL-4 显著高于对照组(38.7±4.7 vs 28.7±6.7，t = 3.16，P = 0.009<0.05);DSS组病变肠段分泌的Th1细胞因子IFN-g较对照组减少但差别无显著性(20.6±7.4 vs 23.2±5.6，t = -0.70，P = 0.50>0.05).由于DSS组IL-4显著升高，同时IFN-g下降，致IL-4/IFN-g升高，显著高于对照组(1.88，1.24).
图1 对照组和实验组小鼠结肠组织的病理变化(HE×200). A: 对照组; B: 实验组.
图2 对照组和实验组小鼠结肠组织GSH的表达(×100). A: 对照组; B: 实验组.
3 讨论
DSS诱导的BALB/c小鼠急性实验性肠炎模型表现为体重减轻，腹泻，血便等.病理学检查发现小鼠左半结肠病变较右半结肠为重，结肠黏膜腺体结构紊乱，单核细胞和多核细胞浸润，黏膜局部糜烂，部分隐窝破坏等[6-7].IBD患者的胃肠道炎症中渗透的大量炎症细胞包括巨噬细胞和中性粒细胞等通过产生反应性氧簇(reactive oxygen species，ROS)而将炎症肠道暴露于氧化应激中.而胃肠道黏膜自身有一些抗氧化防御系统，可以通过中和连续生成的ROS抵消其损害的影响.在这些防御网络中，内生硫氢基团，主要是还原型谷胱甘肽(GSH)起着重要的作用.GSH是一种包含一个巯基的非蛋白三肽，GSH大量存在于各种不同细胞中在多种生化过程中起着重要的作用.GSH构成细胞防御氧化损伤机制中的第一道防线，而且是普遍存在的细胞类型中的主要氧化还原缓冲剂.在其众多功能中，其含半胱氨酸的三肽可以减轻蛋白质的二硫化，减轻自由基和内毒素的毒性作用，并维持细胞内氧化还原的平衡[8].Sido et al[4]的研究发现与健康对照组比较IBD患者半胱氨酸浓度明显减少，其减低水平与疾病临床活动指数相关，去蛋白血浆中总的巯基成分均明显减少，术后3 mo恢复到正常水平.Zea-Iriarte et al[9]发现在TNS(三硝基苯硫酸，trinitrobenzene sulphonic acid)诱导的实验性肠炎中，GSH浓度及谷胱甘肽硫基转移酶，Cu，Zn超氧化物歧化酶均减低，但是谷胱甘肽过氧化物酶却增加.我们的实验研究发现 DSS组病变肠段组织GSH表达明显低于对照组 (2±0.6 vs 3.14±1.0，t = 3.95，P = 0.01<0.05)，与文献报告相似，说明GSH不足与IBD和实验性肠炎的炎症相关，削弱黏膜的抗氧化能力可能会促进肠道的氧化损伤.
Th1和Th2细胞因子反应类型对于小鼠炎症和感染的慢性化和侵袭性可产生影响，是慢性肠道炎症重要的决定因素.Th1/Th2型反应平衡是由分泌细胞因子的类型决定的.Th1型是以通过伴随抗原提呈细胞(APC)生成的IL-12而产生IFN-g为特征.Th2型则是以低IFN-g/高IL-4和低IFN-g/高IL-10为特征[10].本实验中DSS诱导的实验性肠炎小鼠病变肠段分泌的IL-4明显增加，IFN-g下降，致IL-4/IFN-g显著升高，说明DSS诱导的急性实验性肠炎是以Th2型免疫反应为主的炎性改变.Peterson et al[11]和Murata et al[12]曾报道鼠的抗原提呈细胞(APC)或腹腔定居的巨噬细胞中GSH的损耗可使IL-12的分泌减少并导致典型的Th1细胞因子形式向Th2反应模式转化.Peterson et al[11]的研究还显示应用GSH损耗或补充药物时巨噬细胞内GSH的水平可以影响Th1/Th2细胞因子的倾向.且将来源于GSH损耗小鼠的T细胞与未处理的BALB/C鼠的巨噬细胞一起培养可产生正常量的IFN-g，因此IFN-g产量减少是由于巨噬细胞而不是T细胞中GSH损耗造成的.另外Jeannin et al[13]在研究易于产生IL-4的培养细胞系统中发现在培养液中增加GSH的水平可使IL-4的产量以量效依赖的方式减低.这些研究结果充分表明巨噬细胞内的GSH水平对于调节在免疫反应中向Th1或Th2细胞因子反应的发展趋势具有重要的作用.
总之，本研究结果显示DSS诱导的急性实验性肠炎小鼠病变结肠的组织GSH的减少与病变结肠组织分泌的细胞因子IL-4增加、IFN-g减低及结肠黏膜损伤有相关性，但是其机理不明.GSH的表达有可能影响不同类型炎性细胞因子的分泌进而影响黏膜组织的损伤.同时提示肠道黏膜免疫异常在IBD发病机制中的作用不容忽视，特别是巨噬细胞中的GSH的变化是否与黏膜炎症损伤及Th1/Th2细胞因子分泌的相关性有待于探讨.
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免责声明：此文献仅用来做实验参考。
上海金畔生物可以提供供大鼠、小鼠等的肠炎造模产品——硫酸葡聚糖5000（国内文献多使用），硫酸葡聚糖36000-50000（国际文献多使用），TNBS（灌肠实验，美国文献较常见）。其中硫酸葡聚糖造模时采用自由饮用的给药方式较常见，且操作简单，实验结果明显。
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提取DNA的方法总结与比较-分子生物实验
提取DNA的方法总结与比较
dna提取是一项经常要做的实验，下面我们就总结了四种dna提取方法并做详细说明和比较。
一.浓盐法提取dna：
A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿—异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.
三.苯酚抽提法提取dna：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态
四.水抽提法提取dna:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
琼脂糖凝胶电泳常见问题有哪些注意事项是什么-技术文章
琼脂糖凝胶电泳常见问题有哪些注意事项是什么
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳常见为题都有哪些？、
一、DNA带模糊、
1、DNA降解：琼脂糖凝胶电泳试验中要避免核酸酶污染
2、电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多系使用后，离子强度降解，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳实验，建议经常更换电泳缓冲液。
3、所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应该<15℃；检车所有电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
4、DNA上扬量过多：应减少凝胶中DNA上样量。
5、DNA样含盐量过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白
二、不规则DNA带迁移
1、对于λ/HindⅢ片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。
3、DNA变性：以20mM NaCI Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
三、带弱或无DNA带
1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2、DNA降解：避免DAN的核酸酶污染
3、DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
4、对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254mm）的紫外光源
四、DNA带缺失
1、小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
2、分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
3、DNA变性：电泳前请勿高温加热NDA链，以20mM NacI Buffer稀释DNA
4、DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：在脉冲凝胶电泳上分析。
综上所述，琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点：
1.体系配制时候最关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染：引物，酶，超纯水。这些东西最好自己收好，写上个人的名字放好，冰盒上记得带上橡皮筋，这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了，试剂都碰掉。否则，你的试剂被污染了，到时候阴性对照狂出条带，再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净，事先可用小喷壶进行酒精喷雾，固定空气中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染体系。
2.pcr体系要摸准，最好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图，可以在PCR开始时候就把胶倒上（前提是你的PCR总时间在1.5小时左右，并且1.5小时候之后你还在实验室。），让凝胶凉着，这样凝胶的上样孔会比较规则，胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶，千万记得把PCR完毕的样本放4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样，不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然，排枪上样最好选用进口枪头，国产枪头就不要想了。
5.不管电泳室使用的频率高还是低，我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液，避免出现“＾”形条带。