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SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit酶试剂盒Takara Clontech

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SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Clontech 634422 SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit 12 Rxns ￥11,559 SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
Clontech 634423 SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit 48 Rxns ￥39,488 SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
Clontech 634424 SMARTer® Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit 96 Rxns ￥63,143 SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
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SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit—捕获BCR转录本完整V(D)J 可变区
· 起始样品量：10 ng-3 μg来自于脾脏、淋巴结、PBMCs 及杂交瘤的总RNA
· cDNA文库构建经过优化可以灵敏、特异地检测克隆型
· 在大多数情况下，可以准确扩增并通过测序鉴别小鼠IgG亚类
· 经过优化的PCR pooling策略，可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
· 灵活的pooling策略适用于不同的实验需求，以比对、识别原始链序列
 
 
B 细胞是适应性免疫应答的重要组成部分，其表面表达B细胞受体（BCR），可以识别病原体中的特定分子模式。了解BCRs图谱（也就是由特定H,K,L基因片段构成的受体和克隆型多样性）不仅有助于深入了解健康个体中的适应性免疫应答，也有助于了解多种疾病的适应性免疫应答。准确确定免疫系统表达的克隆型和同种型有助于全面了解B细胞群体。
 
新推出的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术，提供了一种灵敏，准确，优化的BCR库分析方法。虽然采用多重PCR可以在一个反应中对多个BCR基因进行扩增，但也被证明在对特定序列进行扩增时存在灵敏度，特异性和偏差的问题，这些都可能带来同种型的鉴别困难。而5’RACE方法减少了变异性并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合可以捕获BCR完整V(D)J可变区，提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。在大部分情况下，通过H/K/L链的下游测序分析可以准确鉴别克隆型，可靠确定同种型。
 
SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
图1. BCR重排过程。
祖细胞发育过程中胚系基因片段经过V,D,J重排形成两条相同的重链。V,J片段重排形成两条相同的轻链。V,D,J片段连接处的核苷酸随机插入或缺失增加了额外的多样性。B细胞经过免疫应答刺激后通过体细胞高频突变（SHM）进一步引入更多的点突变。
 
SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
图2. SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程。
PanelA dT-引物起始合成一链cDNA，经过两轮PCR扩增合成cDNA文库。PCR产物经纯化，片段筛选和质量检测后用于测序分析。
PanelB对于每个样品，在样品中所有mRNA 进行RT反应后，使用者可以通过两轮基因特异性巢式PCR特定扩增IgG 的1-3条链。
 
SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
图3. PCR扩增及pooling流程。
对于每一个样品，在所有mRNA进行RT后，使用者可以特定扩增IgG的1-3条链。每个扩增反应需要5μl RT产物。第一轮PCR后，各取1μl PCR反应产物用于独立PCR反应，分别扩增每条链，同一样品添加相同的indexes，不同的样品添加不同的indexes。经过PCR 2最终扩增后，使用者可以通过Bioanalyzer 或Fragment Analyzer分析每个反应产物，可以以此选择哪条扩增链进行混合测序。
 
SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
图4. 准确扩增所有5种IgG亚类。
以来自于不同IgG亚型的自有杂交瘤（10E8）和两个ATCC杂交瘤样品（HB-8117和TIB-127）的10 ng RNA起始，采用SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit构建包含BCR重链和轻链（kappa）的文库。Panel A Bioanalyzer结果显示了每个杂交瘤重链和轻链的基因特异性扩增结果。在每个样品中都观察到了700-900 bp的预期峰值。电泳图中明显的峰表明在这些杂交瘤中表达kappa链。相反，lambda链测序库相对较宽并且大小低于预期。每个样品中标注为“LM”和“UM”的峰为DNA reference marker。Panel B 采用MiXCR软件（version 1.8）确定比对指标，与所有IG序列进行了比对分析。MiXCR软件对前2个克隆的分析结果显示了V,D,J等位基因及通过软件分析确定的同种型和亚类。
 
Technote：
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Anti BCR pAb (Rabbit, Purified Ig) 品牌：Cosmo Bio

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SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit酶试剂盒Takara Clontech

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SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格（元） 说明书 数量
Clontech 634466 SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit 12 Rxns ￥14,567 SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
Clontech 634467 SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit 48 Rxns ￥42,305 SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
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SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
捕获人的BCR转录本完整V(D)J 可变区
· 起始样品量: 从外周血单核细胞（PBMC）纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA
· 通过添加UMI，校正来自PCR错误、重复序列以及序列错误的读取
· cDNA文库构建经过优化，可以灵敏、特异地检测克隆型
· 可准确扩增并通过测序鉴别人IgG亚类
· 经过优化的PCR pooling策略，可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
· 灵活的pooling策略适用于不同的实验需求，以比对、识别原始链序列
· 可以使用Cogent NGS Immune Profiler Software进行序列数据分析的完整工作流程
 
新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术，提供了一种灵敏，准确，优化的BCR库分析方法。通过5’RACE方法减少了变异性并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。该试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合可以捕获BCR完整V(D)J可变区，提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。
该试剂盒设计的可以从外周血单核细胞（PBMC）纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA，生成Illumina文库。可以为人免疫球蛋白IgG和IgM的重链和轻链（κ和λ）生成数据。该试剂盒还包括特别的分子条形码（UMI），从而可以消除PCR错误或duplication以及测序偏向，从而确保获得更准确和可靠的结果。
测序结束后，可以使用Takara Bio Immune Profiler Software分析数据，该软件使用基于UMI的纠错功能，并可以使用MIGEC（Shugay，2014年）和MiXCR软件（Bolotin，2015年）。该软件支持高质量的BCR分析，包括克隆型计数和鉴别以及V(D)J区域的序列信息。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图1. SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程
 
Panel A 第一链cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV衍生的SMARTScribe反转录酶会在mRNA模板5’末端添加几个非模板核苷酸。SMART UMI Oligos与这几个非模板核苷酸互补结合作为模板，通过RT在第一链cDNA末端添加额外核苷酸序列（也就是模板转换步骤）。然后第一链cDNA经过两轮基因特异性的PCR扩增（详见Panel B）。第二轮的巢式PCR扩增可以确保绝大多数的reads比对到B细胞受体的转录本上。
 
Panel B 第一轮PCR以第一链cDNA为模板，引物包括与Illumina Read Primer 2序列互补的正向引物（PCR1 Universal Forward primer），以及与BCR重链或轻链恒定区互补的反向引物（PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）。以Read Primer 2序列和恒定区起始，第一轮PCR特异性扩增了BCR重链或轻链cDNA的完整可变区及部分恒定区。第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，采用半巢式引物（PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）扩增BCR重链或轻链的cDNA的完整可变区及部分恒定区。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图2. 从1-100 ng B细胞RNA中鉴定出的克隆型信号
 
从1 ng，10 ng和100 ng人CD19 + B细胞总RNA中，利用本试剂盒制备BCR分析IgG，IgM，IgK和IgL文库。为了进行分析，对于1 ng，10 ng和100 ng的RNA起始，分别将文库down-sampling至100,000个，400,000个和5,000,000个reads，然后利用Takara Bio Immune Profiler Software处理。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图3. 散点图展示了用1μg PBMC RNA生成的文库之间的一致性
 
以来自健康供体的1μg PBMC RNA起始，一式两份制备IgG，IgM，IgK和IgL文库。通过down-sampling至1300万次读取来分析该文库。该图包括来自技术重复的所有四个文库（IgG，IgM，IgK和IgL）。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图4. 来自不同供体的PBMC RNA的克隆型计数
 
对来自8个供体的10 ng PBMC RNA（不同颜色代表不同供体），分别使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit来鉴别IgG，IgM，IgK和IgL的克隆型。文库归一化为100,000 reads以进行分析。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图5. 10 ng PBMC RNA文库的测序饱和度评估
 
以来自单个供体的10 ng PBMC RNA起始，使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Kit制备BCR分析文库。
 
Panel A 显示了不同测序深度的IgG克隆型计数，其中蓝线和紫线分别是指经过UMI修正误差和没有经过UMI修正误差的数据。IgG和其他链（IgM，IgK和IgL未在图中展示）按每个文库150万个读数进行测序，然后通过down-sampling至1,000K，500K，200K，100K，50K，10K和5K reads。使用Takara Bio Immune Profiler Software分析不同测序深度的结果。
 
Panel B 维恩图显示了低测序深度（100K）和高测序深度（1,500K）的文库之间重叠的克隆型。
 
 
 
 
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SMARTer Human BCR：
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