Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 货 号 #E3031S-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – DNA聚合酶与扩增技术 – qPCR & RT-qPCR

Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒                              收藏

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#E3031S
100 rxns
11,059.00

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特性

 无需纯化,直接从细胞到 RNA 定量

   试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次探针一步法 RT-qPCR 反应

   有效裂解多种细胞系的 10 10 万个细胞

  仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除

   配合使用 LunaWarmStart® RT Hot Start Taq,提高了热稳定性且可在室温下建立反应体系

   可单独购买裂解模块:Luna Cell Ready 裂解模块(NEBE3032

 

概述

 Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接探针法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分,且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒包含两个模块:1Luna Cell Ready 裂解模块(NEBE3032S)和 2Luna 通用探针一步法 RT-qPCR KitNEBE3006L)。

细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA

 

Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I Luna Cell Ready 蛋白酶的功能,仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂,可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 (相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样,裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料,使整个加样流程可视化。 

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的各个通道,进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中,联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶,通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量(单重或多重)。

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释(100000-10 细胞/50 µl 裂解反应),并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外,经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。

 

 

表一:经验证过的细胞系

 

细胞系

 

特性

菌种

50 ml 裂解体系中的细胞数量

A549

Adherent

H. sapiens, Lung, carcinoma

10 – 100,000

HEK293

Adherent

H. sapiens, Kidney

10 – 100,000

HeLa

Adherent

H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma

10 – 100,000

HepG2

Adherent

H. sapiens, Liver, carcinoma

10 – 100,000

NCI-H460

Adherent

H. sapiens, Lung, carcinoma

10 – 100,000

SK-N-SH

Adherent

H. sapiens, Brain, Neuroblastoma

10 – 100,000

U2Os

Adherent

H. sapiens, Bone, osteosarcoma

10 – 10,000

Jurkat

Suspension

H. sapiens, T lymphocyte, leukemia

10 – 100,000

K-562

Suspension

H. sapiens, Lymphoblast, leukemia

10 – 1,000

 图一:Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

 Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒            货   号                  #E3031S

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞(50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞)到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I Luna Cell Ready 蛋白酶的功能,仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物(相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA)即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。 

 

图二:Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量

 

Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒            货   号                  #E3031S

梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件(37°C 裂解 10 分钟,25°C 灭活 5 分钟),在 50 µl Luna Cell Ready 裂解体系(NEBE3032)中裂解。使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEBE3006),加入 1 μl 细胞裂解物(相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞)对目的基因进行定量,每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标:β-actinTexas Red)和 GAPDHFAM),一个低频靶标:RPL32HEX),的多重结果(A)和单重结果(B),以及相应的扩增效率(E)和线性关系(R2)。(C)所有三个目标的多重和单重的 Cq 叠加证明了这些结果的一致性。

三:Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量

 Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒            货   号                  #E3031S

梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件(37°C 裂解 10 分钟,25°C 灭活 5 分钟),在 50 µl Luna Cell Ready 裂解体系(NEBE3032)中裂解,也可使用柱提法提纯 RNAA.使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEBE3006)对目的基因进行定量,加入 1 μl 细胞裂解物(实心圆,左)或纯化的 RNA(空心圆,右)(上样量相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞),每个浓度的样品都做了重复。在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin 和两个低频靶标 ARF3 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。

图四:Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。

Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒            货   号                  #E3031S

梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件,在 50 µl Luna Cell Ready 裂解体系(NEBE3032)中裂解。相同的样品使用 Bio-RadSingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR, #172-5070)、QiagenFastLane Cell Probe Kit, #216413)和 Thermo FisherCells-to-CT 1-Step TaqMan Kit, A25603并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块,加入 1 μl 细胞裂解物(相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞),对目的基因进行定量,每个浓度的样品都做了重复。5-log 梯度稀释的细胞通过多重实验测试了 β-actin Tye)、GAPDH FAM)和 RPL32 Cy5的扩增。为了使结果标准化,将每个试剂盒总荧光值的 10%(Tye)、5%(FAM)、15%(Cy5)设置为阈值。图中显示了扩增效率(E)及最高与最低的 Cq 值。

试剂盒组分

随该产品提供的试剂

 

储存(°C

浓度

Luna Cell Ready Lysis Buffer

-20

2 X

Luna Cell Ready RNA Protection Reagent

-20

25 X

Luna Cell Ready Protease

-20

25 X

Luna Cell Ready Stop Solution

-20

10 X

DNase I RNase-free

-20

10 X

Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix

-20

20 X

Luna® Universal Probe One-Step Reaction Mix

-20

2 X

Nuclease-free Water

-20

 

 实验需要但不提供的试剂耗材

  磷酸盐缓冲液(PBS

   目标特异性引物

   细胞

   Eppendorf

   PCR联管

   PCR

   qPCR 仪器

   移液器和枪头(为减少交叉污染,应使用带滤芯的枪头)

 储存温度

-20