植物蛋白质提取方法总汇

植物蛋白质提取方法总汇
    植物蛋白是蛋白质的一种，来源是从植物里提取的，营养与动物蛋白相仿，但是更易于消化。含植物蛋白最丰富的是大豆。但在饮食中，植物蛋白和动物蛋白要搭配食用。植物蛋白尽管一般不如动物蛋白好，但仍是人类膳食蛋白质的重要来源。谷类一般含蛋白质6%-10%，不过其中必需氨基酸种或多种含量低（限制氨基酸）。薯类含蛋白质2%-3%。某些坚果类如花生、核桃、杏仁和莲子等则含有较高的蛋白质（15%-30%）。豆科植物如某些干豆类的蛋白质含量可高达40%左右。特别是大豆在豆类中更为突出。它不仅蛋白质含量高，而且质量亦高，是人类食物蛋白质的良好来源。植物蛋白为素食者饮食中主要的蛋白质来源，可用以制成形、味、口感等与相应动物食品相似的仿肉制品。素食者专食不完全蛋白质，会发生营养缺乏症，必须兼食大豆蛋白质。 
植物蛋白是主要来源于米面类、豆类，但是米面类和豆类的蛋白质营养价值不同。米面类来源的蛋白质中缺少赖氨酸（一种必需氨基酸），因此其氨基酸评分较低，仅为0.3～0.5，这类蛋白质被人体吸收和利用的程度也会差些。
一、植物组织蛋白质提取方法 
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入）,准备提取液放在冰上.
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）.
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液,样品制备完成.
蛋白质提取液：300ml
1、上海金畔生物科技有限公司T1150 1M Tris-HCl(pH=8.0)  45ml
2、上海金畔生物科技有限公司G8190 甘油（Glycerol）75ml
3、上海金畔生物科技有限公司P8290 PVP40000  聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!
二、植物组织蛋白质提取方法 
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清.
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇）,摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时）,然后真空干燥沉淀,备用.
4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准）,可临时保存在4℃待用.
5、用上海金畔生物科技有限公司PC0020 BCA蛋白浓度测定试剂盒法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用.
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮.裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M的DTT65ul/ml.
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!
三、组织：肠黏膜 
目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒转混匀,置室温10min
离心：12000 g,10min,4度,弃上清
加入0.3M盐酸胍（G8070 Guanidine HCl   盐酸胍）/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振荡,置室温20min
离心：7500g,5 min,4度,弃上清
重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇 2ml
充分振荡混匀,置室温20 min
离心：7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
离心：10000g,10min,4度
取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右.
解决：提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5－10分钟,效果很好的.
四、植物材料：水稻苗,叶鞘,根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行.
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（上海金畔生物科技有限公司T8100 Trichloroacetic acid,minimum 99.0% titration 三氯乙酸）（丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇）,混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干.
按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度 （温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳.或者-70度保存
六、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample,液氮研磨
(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm,4度,10-15minite
(5) 取上层液,蛋白质就在里面