关于PCR，你知道多少？（五） —-几种特殊的PCR

1、锚定PCR（anchored PCR）

通常采用的PCR反应必须知道欲扩增的DNA或RNA片段两侧的序列，而在大多数情况下对某些序列本身或其旁侧序列并不清楚，“锚定PCR”可以帮助克服序列未知或序列完全未知带来的障碍。

基本做法是：分离细胞总RNA或者mRNA，在反转录酶的作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3’末端加上poly（dG）尾巴。与此poly（dG）相对应的锚定引物poly（dC）为保证扩增特异性，建议此段旁聚（dC）在十二聚以上，5’端可带上某些限制酶序列或其他序列信息。在与基因特异配对的引物参与下，可以扩增出此带同源多聚物尾巴的cDNA序列。

2、不对称PCR（asymmetric PCR）

典型的PCR反应产生一种特定的双链DNA拷贝，不对称PCR可以利用引物浓度的差别，形成单链DNA，便于测序。一般采用50～100：1比例的引物浓度，在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量的单链DNA，分离此扩增产物中的ssDNA可用原引物或第三条内部引物直接测序。

3、反向PCR（inverse PCR）

PCR反应允许扩的DNA片段位于已知序列的两个引物之间。反向PCR的应用则可以对一个已知的DNA片段的两侧未知序列进行扩增和研究。选择已知序列内部没有的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，连接成环状DNA分子，选择合适方向和已知序列两末端互补的引物，经PCR后，可以得到未知序列的DNA片段，用此方法可建立基因组步移文库。

4、多重PCR（multiplex PCR）

PCR技术的一个重要应用领域是检测特定序列的存在或缺失。如果待检测的基因片段存在，经PCR可以产生扩增区带，如果缺失则没有扩增带出现。在许多情况下需要检测的基因十分庞大，有的可达数百上千kb。对此有人提出了多重PCR，即在同一个试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区段。如果某一区段缺失则在相应的电泳图谱上这一区带就会消失。多重PCR和southern blotting 一样可靠，但要简便的多。

5、着色互补PCR（color complementation assay）

着色互补PCR又称荧光PCR，可用于区分长短相近的多种基因成分。其原理是用不同的荧光染料，如红色的罗丹明（POX）和绿色的荧光素（FAM）等分别标记于不同的寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA区段，反应完毕后，利用分子筛除去延伸的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色，据此可以很快诊断出是否某种基因缺失，或者发现某些感染的病毒。