关于PCR，你知道多少？（四）—-Taq DNA聚合酶

—-Taq DNA聚合酶

在PCR反应中，毫无疑问的DNA聚合酶是最关键的因素。PCR最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段。但该酶存在很多缺陷，使之不能广为应用，比如：热稳定性差，每次DNA热变性后大部分酶都被灭活，需要重新加入，每个循环都要重新加入；Klenow酶反应温度较低，引物和模板容易形成非特异性配对，产生非特异性扩增。后来人们曾使用过T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，两者虽使扩增特异性增加，且使DNA合成速度提高了，但是由于其对热的稳定性差而未能广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶发现，才使得PCR技术得到迅速的发展和广泛的应用。

Taq DNA 聚合酶是从一种嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分离提纯得到的。是1969见从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到的，它生长在70～75℃极富矿物质的环境中。

Taq DNA 聚合酶基因全长为2496碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子量为94KD。该酶在70～75℃时具有最高的生物活性。75～80℃条件下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个碱基。70℃时，酶分子延伸速率每秒在60个碱基以上。温度降低时，延伸速率明显下降。55℃时为每秒22个碱基，37℃时约每秒1.5个碱基，22℃时约每秒0.25个碱基。当温度超过80℃时，合成速度也明显下降，这可能和引物或引物-模板复合物的稳定性遭到破坏有关。

Taq DNA 聚合酶具有良好的热稳定性。曾有测试：在92.5℃、95℃、97.5℃下，Taq DNA 聚合酶的生物半衰期分别为130分钟、40分钟和5～6分钟。与大肠杆菌DNA聚合酶I相比较，Taq DNA 聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。因此，在PCR反应中如果发生某些氨基酸的错配，这种酶是没有修正功能的。使用Taq DNA聚合酶的PCR反应出现碱基错配的几率为2.1×10-4左右。

和其他许多聚合酶一样，Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8 mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，测定结果为MgCl2浓度在2.0 mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活Taq DNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当MgCl2浓度在10 mmol/L时可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，因而MgCl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整。一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。另外适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。