反转录酶AMV使用说明（Promega）

1、产品简介

Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV RT，AMV 逆转录酶) 催化以DNA、RNA 或RNA-DNA 杂交体为模板的DNA 聚合反应。它需要引物(DNA 引物比RNA 引物效率更高)以及Mg2+ 或Mn2+。该酶具有固有的RNase H 活性，非离子表面活性剂和氢硫根化合物可在体外增加该酶的活性。

2、特点 

    温度稳定性：由于AMV RT 在较高反应温度下较稳定(37-58℃ )，特别适用于具有复杂二级结构的模板的逆转录。

3、应用

1）cDNA第一链和第二链的合成

2）引物延伸和RNA测序

3）RT-PCR （使用Taq DNA 聚合酶时，50μl PCR扩增体系加10μl 包含AMV RT和提供的AMV RT缓冲液的RT反应液。如果使用的是GoTaq DNA 聚合酶或者PCR Master Mix，50l PCR扩增体系加25?l的RT反应液）。

4、使用方法

1）以使用2g的RNA为例。首先准备无核酸酶的离心管，将模板RNA加入到管内，然后加入引物，引物加入比为0.5g/g RNA，总体积不得大于11?l。最好不要改变引物模板比。70℃加热5min，冰浴5min，短暂离心收集至管底。

2）将下列成分加入到上述退火后的引物-模板混合物中。

AMV RT 5×Reaction Buffer                  5l

dNTP mix                                 2.5l

RNasin Ribonuclease Inhibitor               25units

Sodium pyrophosphate，40mm（预热到42℃）     2.5l

AMV RT                                   200units

无核酸水至最后体积                         25l

3）轻弹混匀，从中取出5l加入到另一含有2-5[-32P]dCTP的试管中。剩余的20l先不要标记。注意：[-32P]dCTP配制时间不超过一周。

4）若使用的是Oligo（dT）引物则在42℃孵育60分钟，若使用的是随机六聚体引物则在37℃孵育60分钟。

5）将两管溶液分为标记的和未标记两种，放在冰上，添加95l的50mM EDTA溶液到标记管中（示踪者），总体积为100l，示踪管可用于核素掺入实验以及凝胶分析实验。

6）利用未标记管中的第一链产物进行第二链的合成反应（参照文献4、5）。

5、随酶提供的物品

dNTP mix 10mM

5×Reaction Buffer

6、参考文献

1. Kacian, D.L.(1977) Methods for assaying reverse transcriptase. Meth. Virol. 6 ,143.

2. Krug,M.S.and Berger,S.L.(1987) First-strand cDNA synthesis primed with Oligo(dT).Meth. Enzymol. 152, 316-25.

3. Mierendorf, R.C. and Pfeffer, D.(1987) Sequencing of RNA transcripts synthesized in vitro from plasmids containing bacteriophage promoters. Meth. Enzymol. 152, 563–6.

4. Universal RiboClone  cDNA Synthesis System Technical Manual #TM038, Promega Corporation.

5. Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.