从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则和注意事项

在分子生物学实验中，我们通常需要分离纯化特定分子量的DNA片段，用于接下来的实验，比如酶切、连接的工作。下面主要介绍从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则和注意事项，其主要原则有两项：

1、去除DNA样品中的杂质：

琼脂糖是从琼脂中提取出来的，其中含有较多的酸根和羟基多糖。目前大多数级别的琼脂糖中含有硫酸酯多糖，这种物质能抑制基因克隆中使用的多种工具酶的活性，如DNA限制性内切酶、连接酶等，在回收DNA时应尽量减少这些物质的污染。不管用哪种方法进行回收DNA，都会用到2.5 mol/L醋酸铵和乙醇沉淀，再用70%乙醇漂洗数次，这样处理，可以有效地去除一些有害的有机分子和无机盐沉淀。近年来琼脂糖的质量大为提高，出现了如低熔点琼脂糖这样的产品，不但熔点降低，其中含有的对DNA工具酶有抑制作用的物质也很少，所以有些低熔点的琼脂糖可以直接在其溶液中对DNA进行内切酶消化和DNA片段之间的连接反应。

2、提高DNA片段的回收率：

DNA的回收率与DNA片段的大小有一定关系，分子量越大，回收率明显下降，大于20kb时，回收率低于20%。这是由于大的DNA片段和DEAE纤维素纸的结合力强，很难洗脱下来。DNA片段的含量也和回收率有较为密切的关系，量越少回收率越低。

回收DNA片段时应注意以下事项：

1、提高DNA上样量；

2、减小DNA回收时的洗脱容积，若容积过大，可先用正丁醇进行浓缩；

3、正确选择回收DNA片段的方法，根据回收片段的大小选择适当的回收方法。