反转录酶M-MLV使用说明(Promega)-技术文章

反转录酶M-MLV使用说明(Promega)

1、产品简介

莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV RT)是一种RNA依赖的DNA聚合酶,能使mRNA(>5kb)转录为cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱,更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLV RT应用于以RNA为模板合成cDNA的第一条链。

注意:M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反转录酶,因此要得到和用AMV 反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。

2、使用方法

1)使用方法简介以用2?g总RNA为例。在无RNase离心管中,加入0.5?g引物至含总RNA的样品中,总体积不大于15?l。70℃,5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复,随后短暂离心使液体集中在离心管底。

2)加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意:不要改变引物的加入比率。

M-MLV 5×Reaction Buffer                       5?l

dATP,10mM                                 1.25?l

dCTP,10mM                                 1.25?l

dGTP,10mM                                 1.25?l

dTTP,10mM                                 1.25?l

Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor         25 units

M-MLV RT                                    200 units

无核酸水至最后体积                          25l

3)轻轻混匀离心管,如果使用随机引物在37℃孵育60分钟,其他引物则42℃孵育。延伸温度在37~42℃之间最佳。

4)M-MLV RT 用于合成cDNA的第一链。往后的合成则需要根据需要自行设计引物再次合成。

3、Buffer组成

M-MLV RT 5×Reaction Buffer

250mM     Tris-HCl(PH 8.3 室温下)

375mM     KCl

15mM     MgCl2

50mM     DTT

4、来源

大肠杆菌表达纯化

5、保存条件

    -20℃保存。避免经常冻融

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