western blot的作用

免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原—抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blot还可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。

Western bloting的注意事项

1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品或者重组蛋白）；阴性对照（即不表达该目的蛋白的蛋白样品，这个一般在数据库寻找或者人为基因敲除所制备的蛋白样品）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）

2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景

3、实验设计时所釆用的抗体批次尽量要一样，尽量的避免抗体批次不同的带来的差异。另外在做样品裂解时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。

4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；浓缩胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时方向要正向上，保持一定的速度（较快），尽量保证点样孔平整。

5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；制作转膜“三明治”时的叠放次序要正确，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。

6、封闭时一般在室温下1-2h，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要严格保证反应时间，一抗的孵育建议是4度摇晃过夜，更有利于抗原抗体的结合。

8、洗膜要注意尽可能地将未结合的一抗二抗洗净，能较好的降低非特异性结合，有利于降低背景；

9、这配置封闭液，一抗，二抗和洗涤液时，请确认缓冲液的pH值（7.4左右为宜），在碱性和酸性条件下不利于抗原抗体的结合。