核酸电泳染色的原理及常用染色液

    核酸的凝胶电泳的载体主要琼脂糖和聚丙烯酰胺，琼脂糖电泳有水平式普通琼脂糖电泳、碱性琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺电泳有非变性聚丙烯酰胺电泳和变性聚丙烯酰胺电泳。那么核酸电泳染色的原理及常见染色液有哪些呢？以下来具体分析一下。

    核酸的凝胶电泳基本原理：

    核酸分子是两性解离分子，在pH值为3.5时碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而当H8.0-8.3时，核酸分子碱基上的氨基几乎不解离，而磷酸基团完全解离，所以核酸分子相当于带负电的阴离子，因此在电场中它就会向正极移动，所以核酸电泳中常用中性或偏碱性的缓冲液进行电泳。

    核酸电泳染色的原理（溴化乙锭染(EB)色法）

    溴化乙锭染(EB)色法原理利用EB可以嵌入DNA的堆积碱基之间，在紫外线激发下，发出红色（橙色）的荧光。可以检测到DNA。适用于琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳、密度梯度离心?。EB和DNA复合物中EB发出的荧光比单独的EB分子发出的荧光强度要大几十倍，因此当核酸含量较高的时候，电泳后不需要对背景处理就可以马上直接观察核酸电泳的带型。

    当利用360nm紫外线照射时，主要由EB分子吸收，灵敏度较低，但对DNA损伤小，长时间的照射仅有少量的核酸断裂，不会形成二具体，而且仅有少量几乎不退色，所以适合对DNA样品的长时间观察和回收等操作。300nm紫外线照射时主要由EB分子吸收，对于观测样品灵敏度是三种波长最高的，且对DNA损伤不是很大，仅有轻微的退色，所以成为观察核酸电泳最适合的波长。

    核酸电泳常用染色液

    1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

    最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCI2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

    在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存。

    2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

    吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

    3、银（Ag+）试剂：

    Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

    4、亚甲蓝（methylene blue）

    可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。