福林酚法测蛋白含量步骤说明

福林酚法测蛋白含量最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

福林酚法测蛋白含量原理：

蛋白质与福林酚试剂反应,生成深蓝色复合物.蓝色的深浅与蛋白质含量成正比.可用分光光度计于500nm波长下进行测定.与标准曲线对照,而确定蛋白质含量.

福林酚法测蛋白含量所需试剂

Folin—酚试剂：

1. 试剂甲

1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液

3) 1%硫酸铜溶液

4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。

2. 试剂乙

称钨酸钠100g，钼酸钠25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

福林酚法测蛋白含量步骤：

1、标准曲线的制作：分别吸取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml标准溶液于小试管中,分别加进不同量的蒸馏水,补足到1ml.各加入5ml试剂甲,混匀后于室温下(25℃左右)放置10min.再加入0.5ml试剂乙,立即混匀,于室温下反应30min.于500nm波长下测定光密度.以吸光值作为纵坐标,蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线.

2、样品蛋白质含量的测定

取1ml样品溶液,加入5ml试剂甲,混匀,于25℃左右放置10min.再加入0.5ml试剂乙,立即摇匀,于25℃左右反应30min,测定吸光值,从标准曲线查出样品蛋白质含量。

福林酚法测蛋白含量的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。