蛋白酶K缓冲液的配置及使用方法和原理

蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。蛋白酶K不被金属离子、螯合剂(e.g. EDTA)、巯基试剂或胰蛋白酶/麋蛋白酶蛋白抑制剂失活。蛋白酶K也是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。
推荐反应缓冲液：
50mM?Tris-HCl (pH7.5),10mMCaCl2。
值得注意的是，蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA
蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。?但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落,细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
保存：
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月
使用：
孵育温度为55至65℃，蛋白酶K?在65oC?的活性比?25oC的活性高12倍。在温度65?oC?之上迅速变性。在95oC?加热10分钟、使用PMSF等蛋白酶抑制剂或用苯酚/氯仿抽提均可失活。理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48小时；理想孵育时间为2小时。
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