免疫沉淀的具体步骤说明

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

溶液制备

缓冲液：

50毫米Tris-HCl pH 7.4；

氯化钠150毫米；

1毫米EDTA；

1% Triton1% x 100；

Na脱氧胆酸；

0.1% SDS；

1毫米的PMSF；

1μ克/毫升抑肽酶；

1μ克/毫升亮肽素；

PBS，pH7.4：

10毫米1.8毫米的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠50毫米，2.7毫米氯化钾

1X样品缓冲液：

65 mM Tris-Cl，pH8.0，10%（v/v）甘油，2.3%（W/V）SDS，

0.01%溴酚蓝，1% DTT。

协议

1、 与pbs-edta或胰蛋白酶收获细胞，计数细胞。

2、裂解细胞在预冷的缓冲液（1毫升/ 107细胞）在4个小时的1小时摇动。

3、离心20 min 14000克在4°c.transfer超游泳的一个新的管。

4、通过洗涤两次制备蛋白质/克琼脂糖珠PBS和恢复到50%液珠悬浮用缓冲液。

5、预先明确的细胞裂解液加入50毫升珠浆每毫升细胞裂解液孵育4°C摇摆10分钟，1000分钟，4分钟，10分钟。将上清液转移到新管。

6、准备IP反应的移液0.5毫升预清除细胞裂解液（相当于5×10 6细胞）进入一个新的管添加1-4毫克抗体反应和孵化每摇摆在冰上3小时。最佳的抗体量要求免疫沉淀的抗原的细胞是从一个给定的国家应该实证检验。

7、添加50%毫升50泥浆珠和岩石为1小时，在4角。

8、离心样品在10000克为15秒微量离心机。仔细地丢弃的上清液。

9、两次洗珠与1毫升缓冲液（去除非特异性相关蛋白），然后3次用1 ml PBS去除洗涤剂。

10、最后，悬珠在60毫升的样品缓冲液，和在95°C下煮沸5分钟，离心样品10000克15秒的离心加载前对聚丙烯酰胺凝胶电泳。