上海金畔生物科技有限公司质粒小量提取试剂盒的使用方法

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是DNA重组的常用载体，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。在质粒提取过程中，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）、质粒的两条链没有断裂、超螺旋开环DNA（ocDNA）、质粒的一条链断裂、松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。

质粒小量提取的方法

1.将3~5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。 如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2～3次。

2.倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100μl悬 浮液（溶液I）中。上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要 用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂 解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。

3.加入150μl裂解液（溶液II），轻柔地颠倒混匀10 次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂； 裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA 的污染及质粒DNA的产率降低。

4.加入150μl中和液（溶液III），轻柔地颠倒混匀10 次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。

5.13,000rpm离心8~10分钟，将上清液小心转入一 37个新的1.5ml离心管中，加入0.4ml纯化树脂（使 用前充分混匀），颠倒混匀3分钟。此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片，并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。

6.将纯化树脂及上清液的混合物吸入离心纯化柱中，13.000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

7.将离心纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80%异丙醇（或80%乙醇），13.000rpm离心1分 钟，倒掉收集管中的废液。 如果离心纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可 用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步 是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。

8.重复第7步1~2次，尽可能将杂质去除。

9. 取出离心纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离 心管，开盖放置2~3分钟，将残留的异丙醇(或乙 醇)挥发干净。加入50μl TE缓冲液(若用于测序， 则加50μl超纯水)于纯化树脂上，不能粘在管壁 上。室温下放置3分钟后，13,000rpm离心1分钟。 此步是将纯化树脂上的DNA洗脱下来。如果对质粒DNA的需求量较大，则重复此步骤1～2次，这 样可以获得高产量的质粒DNA。TE缓冲液或无菌 超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系,可开盖离心。

10.离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒 DNA，取1～2μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15～ 20分钟）检测其纯度并目测定量。 若发现有RNA 污染，可加入0.5μl RNase A （10mg/ml），37℃保温30分钟。此操作不影响其 后续实验。

质粒小量提取注意事项

1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即拧紧盖子。

2、洗脱缓冲液体积不应少于50ul，体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7. 0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

3、如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5-10ml过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

4、DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA、 40ug/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。

 上海金畔生物科技有限公司为生化试剂供应商，专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养、试剂盒、实验耗材等产品。质粒小量提取试剂盒是上海金畔生物科技有限公司自产产品，本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。 离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。 使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。