免疫组化各步骤中应注意事项

 免疫组化，是应用免疫学基本原理即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。在免疫组化试验中应该注意以下事项。

1 ．固定 ：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原 ，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原 有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。 PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2 ．组织脱水，透明 ：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3 ．切片时展片： 有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4 ．烤片： 60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原 容易丢失。

5 ．蜡块及切片的保存： 最好在4℃保存

6 ．脱片问题 ： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化 染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7 ．灭活内源性酶： HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

8 ．暴露抗原 ： 对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9 ．封闭： 在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10 ．抗体稀释： 应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11 ．背景高： 在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12 ．返蓝： 在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13 ．显色： 一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14． 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。