bca法测蛋白浓度步骤与原理
bca法测蛋白浓度原理
工作液为BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂，混合一起颜色变为苹果绿，即为BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA工作液与蛋白质结合时，蛋白质将二价铜离子还原为一价铜离子，一个一价铜离子螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿变成紫色，在562nM处有高的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比，据此绘制标准曲线，检测蛋白的OD值，即可得到浓度值。
bca法测蛋白浓度步骤步骤
标准曲线的绘制：反应体系
加样：96孔板，第一列8个孔
PBS: 20ul 19ul 18ul 16ul 12ul 8ul 4ul 0ul
BSA :0ul 1ul 2ul 4ul 8ul 12ul 16ul 20ul
BCA:200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul
BCA需现配现用，比例为A:B为50:1
样品需稀释25倍或根据实际情况决定
37℃水浴箱中孵育半个小时，用酶标仪读数
酶标仪设置：
选择absorbance可见光吸光度，波长设置为562nM，浓度从低到高分别为0
0.025ug/ul，0.05ug/ul，0.1ug/ul，0.2ug/ul，0.3ug/ul，0.4ug/ul，0.5ug/ul，设置第一列为标准列，设置样本及Blank对照。
读出OD值后，绘制出标准曲线，然后根据样本的OD值算出样本浓度，标准曲线的R值越接近1，说明曲线拟合度越好。
注意：BCA测定时，颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都需要做标准曲线。样品在20-2000ug/ml的浓度范围内有良好的线性关系，因此样品浓度过高需适当稀释。
