pas染色原理及步骤-技术文章

pas染色原理及步骤

 PAS染色法(Periodic Acid-Schiff stain)在组织学上,主要用来检测组织中的糖类。过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基,再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。

本实验介绍了过碘酸-雪夫(PAS)染色的原理及操作步骤。

PAS染色实验原理

胞浆内存在糖原或多糖类物质(如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸(periodicacid)氧化,转变为二醛基(CHO-CHO),与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合,形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。该反应称为过碘酸-雪夫 (PAS)阳性反应,以前也称为糖原染色。

主要试剂

1. 高碘酸氧化液:

HIO4·2H2O1g,蒸馏水加至100ml。此液溶解后保存于冰箱中待用。

2. Schiff试剂:

将1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中。摇荡5分钟,冷却至60度左右,过滤,并向滤液中入1mol/LHCl20ml,混匀。冷至 250C时,加2g偏重亚硫酸钠(或钾)(Na2S2O5)。将此液置带塞的棕色玻璃瓶中,放暗处24小时。加1g活性碳,摇动1分钟,滤纸过滤。保存于冰箱中。

3. 亚硫酸液

100g/L偏重亚硫酸钠6ml;1mol/L盐酸5ml;蒸馏水100ml;每次用前新鲜配置。

4. 20g/L甲绿

甲绿2g;蒸馏水加至100ml

5. 淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液离心取上清液,内含淀粉酶,将麦芽糖淀粉酶0.1~1.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)100ml中。

PAS染色步骤

1. 固定新鲜干燥的涂片用品5%乙醇固定10min,蒸馏水冲洗,待干;

2. 如涂片需要消化,可加唾液或麦芽糖淀酶,置室温消化60min,然后用蒸馏水冲洗;

3. 10g/L高碘酸氧化15~20min,蒸馏水冲洗,待干;

4. 置雪夫染液中室温染色30~60min;

5. 用亚硫酸溶液冲洗3次后,再用自来水冲洗2~3min,待干;

6. 20g/L甲绿复染10~20min;

7. 水洗,待干,镜检。

8. 实验结果计算

   1) 中性粒细胞糖原含量参考标准:

  (-)胞质无颗粒

  ( )胞质呈淡红色,无颗粒

  ( )胞质呈红色,有少量颗粒

  ( )胞质呈暗红色,颗粒较密

  ( )胞质呈紫红色,颗粒极密

   2) 淋巴细胞系:

大多数淋巴细胞呈阴性反应,少数为( )的阳性反应。

  淋巴细胞糖原含量程度参考标准

  (-)胞质内无颗粒

  ( )胞质内有颗粒

  ( )有较粗红色颗粒

  ( )有粗大红色颗粒

  ( )颗粒粗大并有红色块状

   3) 红细胞系:

  幼红细胞和红细胞呈阴性反应

  红细胞系列糖原含量程度参考标准

  (-)胞质无颗粒

  ( )有少数红色颗粒

  ( )有较粗红色颗粒或弥漫红色

  ( )有粗大红色颗粒或深红色

  ( )有粗大红色块状或紫红色

   4) 巨核细胞:

  巨核细胞和血小板染色反应均为阳性

  巨核细胞糖原含量程度参考标准

  (-)胞质无颗粒

  ( )少量糖原包涵体

  ( )中等量糖原包涵体,定位于核膜出或分散胞质中,占胞质1/3

  ( )大量糖原包涵体分散于胞质的1/2

  ( )糖原包涵体充满整个胞质

 5) 单核细胞呈阴性或阳性,颗粒细小,往往位于胞质边缘:

  浆细胞大多呈阴性,少数为红色颗粒阳性;

  组织细胞为阴性反应;

  巨噬细胞可呈阳性,为红色颗粒反应。

注意事项

1. 所用染色缸及器具应十分清洁、干燥;

2. 固定试剂不同,染色效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲醛蒸气,其中乙醇固定后糖原颗粒明显,各成熟粒细胞的反应有较明显的颜色差异,易于判断阳性反应的程度,且唾液消化后的对照标本没有假阳性,故通常选用乙醇为固定剂;

3. 10g/L高碘酸溶液质量要保证,变黄则不能用,氧化时间要准确,否则将导致假阳性或假阴性;

4. 碱性品红试剂对染色的影响不同品牌的碱性品红染色效果不一,碱性品红的质量是试验成败的关键因素之一。希夫(Schiff)染液应避光保存,无色,变红则失效;

5. 染色后标本应及早观察和记录,染色后标本保存8天后,将逐渐褪色,保存时间延长,褪色更为明显。

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