别名	巯基蛋白琼脂糖偶联树脂 PabPur SulfoLink Beads
英文名称	SulfoLink Coupling Resin

SulfoLink Coupling Resin 是一类预活化树脂，可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化，进而对免疫血清中的抗体进行纯化。

产品性能：

纯化流程

    SulfoLink Coupling Resin 针对巯基和氨基的偶联条件有所差异，对于含有巯基抗原偶联请参考1.1 流程，对于含有氨基抗原偶联请参考1.2 流程。

1.1 含巯基抗原的偶联流程

1.1.1 缓冲液准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤。

偶联液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，pH 8.5

封闭液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，50 mML-半胱氨酸，pH 8.5

保护液：20 mM 磷酸盐缓冲液，20% 乙醇，pH 8.0

结合/洗杂液： 20 mM 磷酸盐缓冲液，pH 8.0

洗脱液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5

1.1.2 抗原准备

抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态（可以使用Ellman’s Reagent 检测自由巯基的含量）。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂TCEP（Tris(2-carboxyethyl) phosphine），TCEP 溶液很稳定，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中TCEP 的添加量不超过12mg，需要自己进行优化。如果使用DTT 等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为1-3 mg/ml 的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。

1.1.3 抗原偶联

1)      取适量的SulfoLink Coupling Resin，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3 倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9 倍柱体积的偶联液。

2)      关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至于合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。

注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。

3)      将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出，再用3 倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出。

注：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent 检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。

4)      关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。

5)      将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。

注：如果立即使用，可以参考1.1.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。

1.1.4 抗体纯化

1)      将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5 倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。

2)      将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3)      用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。

4)      使用5-10 倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。

注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0 的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。

5)      依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5 倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被细菌污染。

1.2 含氨基抗原偶联流程

1.2.1 缓冲液准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤。

偶联液：0.1MNaHCO3，0.5MNaCl，pH 8.5

封闭液：50 mMTris， 5 mMEDTA-Na， 50 mML-半胱氨酸，pH 8.5

保护液：20 mM 磷酸盐缓冲液，20% 乙醇，pH 8.0

结合/洗杂液: 20 mM 磷酸盐缓冲液，pH 8.0

洗脱液: 100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5

1.2.2 抗原准备

氨基是一种比较稳定的基团，所以，对于含有氨基的抗原没有太特殊的要求。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5-10 mg/ml的抗原溶液。

1.2.3 抗原偶联

1)      取适量的SulfoLink Coupling Resin，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3 倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9 倍柱体积的偶联液。

2)      关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育3-5 小时，或者2-8℃震荡孵育过夜（12-15 小时）。

注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。

3)      将上述反应体系取出，转移至重力柱中，其中的抗原溶液，并收集流出，再用3 倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，留待测试。

4)      关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。

5)      将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。

注：如果立即使用，可以参考1.2.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。

1.2.4 抗体纯化

1)      将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5 倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。

2)      将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3)      用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。

4)      使用5-10 倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。

注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0 的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。

5)      依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5 倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被细菌污染。

1.3 SDS-PAGE 检测

将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

问题及解决方案