生物制药中DNA残留检测——DNA Extractor® Kit


生物制药中DNA残留检测——DNA Extractor® Kit

 

 

  宿主细胞DNA(Host Cell Proteins) 对于具有商业规模的生物药品中,治疗性蛋白药物在细胞培养中的表达是一种比较便宜有效的方法。但是这些产品在生产和纯化过程中,很容易引起宿主细胞DNA残余污染。尽管残余宿主细胞DNA对治疗性蛋白药物的影响在很大程度上还是未知的,但是也有研究表明宿主细胞DNA可能包含一些有害的DNA片段,使其具有传染性和致瘤性。因此,在生物制药中,对宿主细胞DNA的检测是非常有必要的。 
Wako
(日本和光纯药)对于生物制药中的宿主细胞DNA残留,可提供以下试剂: 
DNA Extractor® Kit

295-50201 50tests 

 

特点 


可与Threshold系统配合使用进行
能用于生物制药、血清中的DNA提取
单独的离心管无交叉污染,提取的核酸可应用于下游实验 
可获得高质量高回收率的DNA
使用的方法为碘化钠法(Sodium Iodide Method),比传统的方法更为环保
高灵敏度,可提取低至10
pg的DNA

 

 

◆DNA Extractor® Kit实验方案


方案1:血清中DNA提取操作步骤


试剂准备:

1) DNA提取之前,试剂提取如下:

26mL碘化钠溶液加入6mL蒸馏去离子水稀释,

再加入1mL月桂酰肌氨酸钠和65μL糖原溶液并混合均匀。 

2) 向洗涤溶液(B)加入2μL糖原溶液并立即混合均匀。

 


注意事项:

1)用于稀释Nal溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。

2)配制好的洗涤溶液(B)在 4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原 溶液到无菌离心管中至

   合适体积即可。

3)在保存期间Nal溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。 DNA提取步骤:

1)吸取100μL的血清样品加入1.5mL微量离心管;

2)再加入300μL配制好的Nal溶液至离心管并混合均匀;

3)将离心管在60℃恒温容器中加热15分钟;

4)取出离心管,加入400μL异丙醇至离心管并混合均匀;

5)离心管在室温静置15分钟后离心10,000g 15分钟;

6)尽可能多地吸取上清液,将离心管倒置在纸面上除去残留溶液;

7)加入1mL 配制好的洗涤溶液(B)重悬浮得到的白色沉淀,并使白色沉淀从离心管壁上弹开;

8)短暂离心10,000g 5min,去除上清液,将剩余沉淀真空干燥,用于后续的DNA分析。

 

 

方案 2: Threshold* 系统DNA定量法的预处理


试剂预处理 :

1) 将65μL糖原溶液加入26mL碘化钠溶液;

2) 将2μL糖原溶液加入40mL洗涤溶液(B),立即混合均匀。

 

注意事项:

1) 用于稀释碘化钠溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。

2) 配制好的洗涤溶液(B)在 4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原溶液到无

    菌离心管中至合适体积即可。

3) 在保存期间碘化钠溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。

4) 提取步骤应在DNA变性之前,因此重要的是使用无菌技术尽可能降低DNA污染。预先包装好的无

     菌吸管、无菌试管和手套都要经过此步骤。

 

DNA提取步骤:

1) 吸取400μL或500μL的样品加入2mL无菌带盖微量离心管并混合均匀;

2) 吸取20μL的月桂酰肌氨酸钠溶液加入微量离心管并混合均匀;

3) 再加入500μL包含糖原的碘化钠溶液至混合溶液,涡旋后在40℃保温15分钟;

4) 加入900μL异丙醇至混合溶液,涡旋后静置于室温15分钟;

5) 短暂离心10,000g 15min后,能看见管壁有白色沉淀,吸取上清液后将离心管倒置于纸面去

    除残留溶液;

6) 加入800μL 洗涤溶液(A)至离心管,剧烈涡旋使白色沉淀从离心管壁上弹开;

7) 短暂离心10,000g 5min后,去除残留溶液;

8) 加入1500μL包含糖原的洗涤溶液(B)至离心管并涡旋,短暂离心10,000g 5min后吸取上清液,

    剩余的白色沉淀包括DNA和糖原载体;

9) 加入分析用缓冲液 (Zero Calibrator buffer) 使白色沉淀溶解,用于后续的DNA分析。

 

注意事项:

请于各步骤使用搅拌器将溶液搅拌均匀。样品溶液里含有DNA酶时,进行步骤2之前请先进 行步骤3。步骤4里样品溶解不完全时,请把保温温度升至40-60℃帮助溶解。但是含有部分蛋白(γ- 球蛋白)或高浓度蛋白的样品(>50mg/mL),加热可能会导致蛋白聚集,请注意。

* 为Molecμlar Devices公司注册商标,是使用生物传感器的高灵敏度分析装置。

 

 

参考文献

1. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, T.    and Matuura,: Simple Procedure of DNA isolation from human seru

Nucleic Acids Res., 19, 5792 (1991)

 


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