ULTRARIPA® Kit 应用数据


ULTRARIPA® Kit 应用数据



◆评价ULTRARIPA® Kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的能力


(数据提供:东京大学 大学院药学系研究科 卫生化学教室)

  用PBS清洗COS-1细胞后,用SDS buffer、1% Triton X-100 buffer,ULTRARIPA® Kit A buffer以及ULTRARIPA® Kit B buffer溶解,离心(14,000 rpm, 5 min, 4°C)。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的SDS-PAGE sample buffer变性溶解。通过SDS-PAGE / Western印迹评价脂筏标记物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1%Triton X-100和RIPA缓冲液中,大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜组分中,然而在ULTRARIPA® Kit B缓冲液中几乎全部溶解了。


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各缓冲液的成分:

●  SDS buffer(2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl)
● 

ULTRARIPA® Kit A buffer (1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mM Tris-HCl (pH8.0),150 mM

NaCl,0.5% Sodium Deoxycholate)

●  ULTRARIPA® Kit B buffer (不公开成分)
●  1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl)

 

◆用ULTRARIPA® Kit观察NGF刺激依存的Integrin的脂筏转换


(数据提供:国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部)

使用的样本:小鼠来源原代培养DRG神经细胞(DIV13,~106 cells/35 mm dish)

目标蛋白:Integrinβ1, Flotillin 1

 

步骤:

1.在存在和不存在50ng/mL NGF的情况下培养神经细胞(各准备2个样品)

2.用PBS清洗COS-1细胞后,添加150 μL ULTRARIPA® Kit A-buffer,并在冰上孵育

3.离心分离可溶性组分①和不溶性组分

4.准备的2个A-buffer不溶性组分的样品,其中一个管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其完全溶解②

5.添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性组分中,悬浮沉淀物

6.离心并分离B-buffer可溶性组分③和不溶性组分

7.添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性组分中,使其完全溶解④


结果:

  与NGF刺激中未看到Flutillin的波动相比,观察到了Integrinβ1通过NGF浓缩在RIPA不溶性部分中。


ULTRARIPA® Kit 应用数据

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◆使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物


(本数据是在Funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授,住冈晓夫助教共同研究下取得)

■  直接添加B-buffer验证溶解效率

使用的样本:小鼠脑组织(海马体+大脑皮质)来源的P2膜组分*

*P2模组分的回收步骤


  从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质,添加匀浆缓冲液(10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors)并用Dounce型匀浆器破碎。

  低速(×1,000 g)10分钟离心组织破碎液,去除沉淀的核组分(P1组分)。

  上清(S1)组分用中速(×13,200 g)20分钟进一步离心,去除上清(S2)组分,回收沉淀的膜(P2)。

 

使用缓冲液条件:

SDS:2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

1% Triton:1% TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

ULTRARIPA® Kit

A-buffer(RIPA):1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

B-buffer:非公开

 

步骤:

1. 添加各缓冲液100 mL至P2组分中,在冰上进行超声处理

2. 高速(×100,000 g)离心破碎液,沉淀不溶性组分,回收各可溶性组分

3. 添置100 μL 2% SDS缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。

 

结果:

  在经过验证的所有神经突触相关蛋白中,ULTRARIPA® Kit B-buffer的溶解效率比1%Triton X-100和RIPA缓冲液(A-buffer)高。


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■  验证神经细胞膜来源RIPA不溶性组分的B-buffer溶解效率

使用的样本:小鼠脑组织(海马体+大脑皮质)来源的P2膜组分


步骤:

1. 添加200 μL A-buffer(RIPA)至P2膜组分,在冰上进行超声处理

2. 高速(×100,000 g)离心破碎液,除去可溶性组分,单独分离不溶性组分。

3. 添加200 mL 2% SDS,A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性组分,在冰上进行超声处理

4. 离心(×100,000 g)各溶液,并分离可溶性组分和不溶性组分

5. 为了检测B-buffer不溶性组分中残留的蛋白,添加2% SDS至B-buffer组分中使其完全溶解

 

结果:

发现B-buffer能够溶解神经细胞膜的RIPA不溶性组分中包含的大多数蛋白。

此外,还可以高效提取NMDA型谷氨酸受体亚基的GluN1和GluN2B。

另一方面,尽管PSD 95的可溶性有所提高,但发现它仍残留在B-buffer的不溶性组分中。

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■  使用ULTRARIPA® Kit分析神经突触蛋白复合物

使用的样本:小鼠脑组织(海马体+大脑皮质)来源的P2膜组分

目标:NMDA型谷氨酸受体NMDAR(GluN1/GluN2B)

          AMPA型谷氨酸受体 AMPAR(GluA1/GluA2)

 

步骤:

1.  添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜组分,在冰上进行超声处理;
2.  高速离心(×100,000 g)破碎液,获取可溶性组分;
3. 

添加1 μg对照IgG或抗GluN2B抗体或GluA2/3抗体至100 μL可溶性组分,并在4°C下反应1小时后,添

20μL bed vol Protein A磁珠并反应1小时;

4.  用PBST(0.05% Tween20 in PBS)清洗磁珠3次;
5.  添加1×SDS-PAGE样本缓冲液,在100°C加热条件下洗脱。


结果:

使用ULTRARIPA® Kit B-buffer,NMDAR,AMPAR都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。

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*SYN (Synaptophysin)

相关产品信息请点击文字:UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装