根据HRP的催化特性，ELISA中一般使用过氧化氢(H2O2)作为HRP底物之一，在供氢体(即色原底物)存在时，HRP与H2O2的反应迅速而又专一。由图4可见，HRP被H2O2二价地氧化形成复合物I，而复合物I又可与氢供体的二步连续的单价相互作用而还原至起始状态。复合物Ⅱ是被氧化的带一个电子的中间产物，当H2O2过量，由于复合物Ⅲ或Ⅳ的形成，酶活性受抑制(以后补上)。30％的H2O2并不稳定。由于H2O2既为HRP的底物，也为其抑制剂，因而ELISA要想得到满意的测定结果，H2O2必须限定在一定的浓度范围内，终浓度通常为2～6 mmol/L。然而在实际研究工作中，一般很少注意这一点。大多数研究者所使用的H2O2的浓度常较理想反应所需的量大2～4倍。吸附于固相的HRP较游离的HRP更易受过量H2O2的抑制。如果30％H2O2贮存液浓度经测定证实确为30％，则稀释10 000—12 000倍常是较为理想的底物。H2O2的摩尔消光系数为10mm光径240nm波长下为43.6，因此，可通过这种方式来检测H2O2工作溶液的浓度。

固相ELISA中，当温度高于20oC时，HRP活性常较低，在底物溶液中加入非离子去垢剂聚山梨醇-20或TritonX-100可延迟HRP的失活，且可使反应温度加大，但非离子去垢剂的这种酶活性保护效应依氢供体的不同而有差异。如以2,2’–联氮–双-[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸(ABTS)为氢供体，则只能保护20％的酶活性，而以邻联茴香胺(ODA)为氢供体时，酶活性的保护提高至90％。

HRP之所以是迄今为止在ELISA中应用最为广泛的标记用酶，主要是因为其一方面易于提取，价格相对低廉；另一方面性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。

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