革兰氏染色液的原理和方法
革兰氏染色主要用来区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。先来介绍一下这个实验原理:
因为革兰氏阳性菌的细胞壁较厚,肽聚糖网层较厚且交联致密,没有类脂存在,而革兰氏阴性菌的细胞壁薄,肽聚糖网层薄且交联较差,外膜上存在较多的类脂。两者的这些区别造成了在进行革兰氏染色后出现不同染色结果。
革兰氏阳性菌:当结晶紫染液和碘液相遇后,形成不溶性的有色复合物,当用乙醇脱色时,因为胞体的失水,而使得肽聚糖交联更加紧密,网孔缩小,把紫色复合物截留在细胞内,从而使细胞呈现紫色;而革兰氏阴性菌与乙醇脱色时,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能截留形成的紫色复合物,所以呈现无色,再经沙黄复染后呈现红色。
革兰氏染色方法:
1、涂片:利用移液枪吸取10ul的菌液滴在载玻片,用烧红的涂菌棒涂抹均匀,面积适中。
2、干燥与固定:将载玻片放置在酒精灯火焰上方一定距离处,涂菌面向上,将菌液烤干,温度不宜过高,炙烤不宜时间太长,固定就是将涂菌面向上,载玻片快速在火焰中过2-3次。
3、初染:在菌液面上滴加1-2滴草酸铵结晶紫,染色1min
4、水洗:在小股水流下冲洗,直至无色为止。
5、媒染:吸取300ul碘液滴在样本上,染色1min。
6、水洗:在小股水流下冲洗,直至无色为止。
7、脱色:倾斜玻片,滴加95%的乙醇,约30s,再水洗一次。
8、复染:在样本上滴加沙黄染液1-2滴,染色1min。
9、水洗:在小股水流下冲洗,直至流过玻片的水无色为止。
10、干燥与观察:用纸擦去水,干燥后在显微镜下观察,菌体呈现紫色的是革兰氏阳性菌,呈现红色的是革兰氏阴性菌。