细胞凋亡/自噬检测试剂盒

细胞自噬检测试剂盒 Cyto-ID^® Autophagy Detection Kit – ENZ-51031

   

　　该染料进行过优化，可在活细胞内进行实验，无需细胞转染。

　　2014 年 6 月的 Nature 杂志刊登细胞自噬在抗帕金森病方面，抑制位于线粒体中的去泛素酶 USP30 的活性会增强神经元中受损线粒体的自噬和清理，有益于帕金森病的治疗。2013 年 7 月 Journal of Clinical Investigation 杂志刊登研究 II型糖尿病个体自噬作用可抑制毒性的胰岛淀粉样多肽（IAPP）的过量积累，从而保护胰腺  β 细胞免于受损。研究者希望早日找到保护胰腺  β 细胞的靶点以开发出 II 型糖尿病的新疗法。美国加州大学洛杉矶分校的生物学家发现，果蝇机体和大脑的衰老延缓与激活肠道或神经系统中的关键的能量传感器 AMPK 基因后引起的自噬过程加快密切相关。Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒是 Enzo 公司的拳头产品，该产品可代替传统 LC3-GFP 法，通过荧光示踪物来选择性检测自噬通路中的各种囊泡包括自噬前体、自噬体和自溶酶体，用于流式细胞仪，无需转染，就能在荧光显微镜下跟踪活细胞的自噬过 程进行定量分析，或用流式细胞仪进行高通量筛选，甚至能标记原代细胞。并且该产品可以进行自噬通路的动力学分析，为研究者展现自噬体形成和消除之间的动态 平衡。Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒也可以与检测其他细胞器的染料结合使用：与 Mito-ID^® Red 联用区分检测细胞自噬和线粒体自噬，与 ProteoStat^® Protein aggregation assay 联用检测聚集小体及小体中的变性蛋白，与 Lyso-ID ^® Red detection kit(GFP-Certified) 联用区分检测自噬体和溶酶体，与Lyso-ID^® Red cytotoxicity kit(GFP-Certified)  kit 联用监测自噬与细胞毒性的相关性。

◆原理

　　该试剂盒利用专利性的染料，可选择性对前自噬体、自噬体和自噬性溶酶体进行染色，在荧光下显绿色，而对溶酶体的染色极少。

◆优点・特色

●　无需进行细胞转染代替传统的GFP-LC3法
●　新颖的荧光探针可特异性地检测最低溶酶体背景的自噬囊泡
●　特别适用于筛选自噬激活剂与抑制剂

Starvation 诱导细胞自噬，左图绿色为自噬体，右图为对照。蓝色为荧光染料 Hoechst 染细胞核。

General Cells	Cancer Cells
osteosarcoma-derived cells	melanoma cells
hepatocytes	ovarian cancer cells
Jurkat T cells	breast cancer cells
bovine aortic endothelial cells	cervical adenocarcinoma cells
B-lymphoblastoid cells	colon adenocarcinoma cells
Chinese hamster ovary (CHO) cells	SK-N-SH neuroblastoma cells

相关产品资料请点击下载：活细胞荧光分析 Ver.3

相关产品

产品名称	特点
分析试剂盒
p62 ELISA kit	用于自噬研究，高效、定量的 p62 ELISA 试剂盒，可检测低至 100 pg/mL的 p62 进行。
NBR1 ELISA kit	率先投放市场，用于自噬研究的 NBR1 定量检测试剂盒，可检测65pg/mL的 NBR1。
Screen-Well® Autophagy library	不同结构和机制的化合物，用于胞内和体外研究，促进/抗自噬分子的作用机制。
抗体
LC3, mAb (2G6) (fluorescein labeled)	识别所有单体（LC3-I）和 PE 交联（LC3-II）形式的人LC3/GABARAP 蛋白 (Atg8 同系物 ) 。
LC3, mAb (5H3)	识别人 LC3。识别两种形式的内源性 LC3。
LC3B, mAb (2G6)	识别人、小鼠、大鼠、猴和仓鼠 LC3B。识别两种形式的内源性   LC3B。
LC3B, mAb (5F10)	识别人、小鼠、大鼠、狗和仓鼠 LC3B。识别这两种形式的内源性LC3B。
小分子
3-Methyladenine	PI3 激酶抑制剂，著名的自噬抑制剂。
Rapamycin	具有强效免疫抑制剂的活性。它与FKBP12形成的复合物结合一个效应子，从而抑制IL-2和其它生长因子。

Cyto-ID^® 检测试剂盒 Q&A

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂与活细胞孵育的最长时间是多少(几分钟/几小时/几天)？
A：    我们建议37℃孵育不超过30分钟。很多实验表明，孵育1小时不会伤害细胞。孵育超过1小时，一些细胞看上

          去状态不好。

Q：    是否可用荧光显微镜观察3D培养细胞的自噬？
A：    我们没有用该染料染过3D细胞，但是一小撮细胞是可以染色的。活体组织的话，由于染料的渗透性不好，不

          能进入样本的内部，所以效果不理想。染白细胞是可以。

Q：    用双重染料染在37℃孵育30分钟后，细胞状态不好开始皱缩。有些细胞也从板上脱离，阳性对照和DMSO对

          照没有观察到特异性染色。
A：    对于比较敏感的细胞，优化流程如下：
          1.使用PBS/5%FBS或者完全培养基作为assay buffer，最好不含酚红。
          2.如果细胞状态仍然不好，建议染色时间缩短至15~20分钟。
          3.减少染料的浓度至1000×稀释。需要显微镜观察时延长荧光照射的时间。
          4.可能光褪色会导致信号模糊。建议使用封片剂防止光褪色。

Q：    用流式检测的话，样品在用Cyto-ID^® 自噬检测试剂孵育后多久可用流式观察？操作手册是说30分钟。是否可

          以在检测之前短暂的将样品放置在冰上？
A：    可以将样品放在冰上延长孵育的时间。一般的经验法则，尽可能缩短活细胞与染料的结合。缺氧，低温或者

          其他应激状态也可以诱导自噬。

Q：    GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒（ENZ-51002），Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)是

          否可以同时染色，检测细胞凋亡，坏死和自噬？
A：    GFP-Certified™ 细胞凋亡/坏死检测试剂盒（ENZ-51002）和Cyto-ID^® 检测试剂盒(ENZ-51031)不能配合

          使用，因为细胞凋亡和自噬检测的染料都发绿色荧光。这两个试剂盒可以平行使用。比如，用十字孢碱（

          Staurosporine）处理细胞，一部分样品用GFP-CertifiedTM细胞凋亡/坏死检测试剂盒检测，一部分样品

          用Cyto-ID^® 检测试剂盒检测。

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)的Cyto-ID^® 自噬检测试剂能否与ProteoStat^® 蛋白聚集检测（ENZ

          -51023）的ProteoStat^® 检测试剂联合使用？
A：    Cyto-ID^® 绿色自噬检测试剂与ProteoStat^® 检测试剂发的荧光颜色不同，他们可用于同一实验，客户需要优

          化实验流程。

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂的原理是什么？
A：    染料是申请专利的。该染料是阳离子两性示踪剂（CAT）染料，跟很多阳离子化合物一样可以快速进入细

          胞。染料穿过细胞膜双分子层后被动扩散，不需要蛋白结合 或者转运子活性。可滴定部分的筛选使的染料

          不会再溶酶体聚集，能够标记自噬通道相关的液泡。另外，染料的发射光密度增强后可以标记自噬液泡相

          关片层膜结构。我们可以提供染料染自噬液泡的相关数据。

          诱导自噬溶酶体，比如用氯喹或者baflimyocin处理后，会导致荧光变亮（250~300%）。雷帕霉素诱导自

          噬后能够用3-MA抑制。在EBSS 中氨基酸缺乏会导致1小时后在自噬液泡中染料的积累，这种积累是可逆

          的（补充营养后即可恢复）。我们有一系列用于研究自噬的化合物（Screen-Well^® Autophagy library）

Q：    与单丹磺酰尸胺(MDC)相比，Cyto-ID^® 自噬检测试剂有哪些优势？
A：    MDC需要365nm UV荧光照明，与通常流式配置的488n激发源不兼容。Cyto-ID^® 自噬染料是488nm激发波

          长，绿色的发射荧光，可以高亮自噬通道不同的液泡成分。需要注意的是，与lysomotrophic染料不同，MD

          C，LysoTrackerTMRed，吖啶橙主要是染溶酶体的，Cyto-ID^® 自噬染料只能染一点点溶酶体，主要是染自

          噬溶酶体和早期自噬部分的选择标记物。

Q：    与GFP-LC3转染细胞相比，Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒(ENZ-51031)的优势是什么？
A：    Cyto-ID^® 检测试剂盒(ENZ-51031)的最大优势是不用转染细胞。转染很短暂，不同实验需要再购买相关试

          剂。由于细胞过表达，会导致GFP-LC3聚集，结果呈假阳性。转染效率低于100%，有些细胞不会表达必要的

          GFP组件。该试剂盒检测的自噬，细胞群的一致性会更好。不需要每个细胞系都进行转染。也可以标记原

          代。细胞原代细胞不容易进行转染。

Q：    有哪些细胞系或者原代细胞可用Cyto-ID^® 自噬检测试剂？
A：    用该试剂盒见检测过的代表性的细胞和细胞系包括肝细胞，SK-N-SH神经瘤细胞，CHO细胞，骨肉瘤来源细

          胞，黑素留细胞，乳腺癌细胞，宫颈癌细胞，卵巢癌细胞，B淋巴瘤细胞，结肠癌细胞，HepG细胞，

         Jurkat T细胞，牛大动脉内皮细胞（BAEC）。

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂能否与其他染料配合使用，区分细胞核内体和自噬内涵体？
A：    Cyto-ID^® 红色长期示踪剂染料（ENZ-51037）能够染细胞质膜，通过细胞内吞存在于细胞中。Cyto-ID^® 红

          色染料与Cyto-ID^® 自噬检测试剂能够高亮异体吞噬vs自噬。也可以Cyto-ID^® 自噬检测试剂与Lyso-ID^® 红色染

          料或者LysoTracker™ 红色染料进行活细胞染色，荧光显微镜观察。

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂的稳定性如何？
A：    荧光染料会发生光褪色，但是这种染料比荧光素更稳定。按照操作手册出来荧光染料。

Q：    Cyto-ID^® 自噬检测试剂盒染色后是否可固定细胞？
A：    在操作手册中提供了固定细胞的流程。不推荐用表面活性剂给细胞打孔，定位的荧光染料丢失。

Q：    活细胞检测时，荧光信号强度可维持多长时间？
A：    细胞诱导后发生自噬，在分析前染色。诱导时间少于1小时或者诱导几天，诱导时间取决于自噬诱导剂。我们

          没有在活细胞上进行长时间的染色，有客户发现可以至少染色24小时。