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利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量
检测氨基酸饮料的氨基酸
和光纯药工业株式会社 试剂化学实验室 須藤 勇紀
◆前言
自从天冬酰胺在1806年从芦笋汁中分离成功以来，人们开始发现氨基酸，并将其大致分为四类，即作为营养物质的利用，作为味道成分的利用，生理作用的利用，反应性的利用，这些功能在我们生活中是不可缺少的 1）。另外，在动物体内无法合成的氨基酸既是动物的必需氨基酸，也是很重要的食物营养素。
在日本实施的1991年特定保健食品体系、2002年保健功能食品体系、2015年功能性食品体系过程中，也是期待着将氨基酸作为保健品用于国民自我治疗药物的实践中 2,3）。功能性标示食品制度因其呈报制度更便于新企业参与。2017年3月特定保健用食品的数量为1,127件，功能性标示食品从以往的815件正在急剧增加中。从而可预计保健食品市场将迅速扩大。氨基酸作为营养素的功能已被广泛认可，以饮料，健康饮料，果冻等多种形态的氨基酸的食品流通于市场中 1），未来也将继续推出更多含有氨基酸的新型食品。
◆3-氨基吡啶-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（APDS）衍生化
高效液相色谱法（HPLC）中的氨基酸分析衍生化技术是很久以前便存在的，因此市面上也存在许多种类的衍生剂，其中包括茚三酮和邻苯二甲醛。本次介绍的APDS氨基酸衍生化技术是一种具有高疏水性，且因其高电离效率更有利于反相LC/MS（/MS）的方法。
该方法不仅用于味之素株式会社的“Amino index® 癌症风险筛选”（AICS）7）。在食品分析中也用于氨基酸分析专用装备（UF-Amino Station）的分析案例 8）。
Wakopak® Ultra APDSTAG® 是一种专用分析柱，可利用LC / MS / MS仪器对APDS-氨基酸衍生物进行分离分析。本次我们介绍的是使用该柱分析市售氨基酸饮料中的氨基酸种类。
◆实验方法和结果分析
样品前处理和衍生化的流程如图1所示，LC / MS / MS条件如表1所示。 定量采用内标法进行。在这次实验的饮料中，据材料记载氨基酸种类含有甘氨酸（Gly），丙氨酸（Ala），缬氨酸（Val），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和精氨酸（Arg）这六种种类，但市售饮料中都不含表1的No.13〜20的氨基酸类。图2显示的是市售饮料中的6种氨基酸的MRM色谱分析图。接下来，将氨基酸标准品加入到获得该色谱的样品中，并进行回收实验。图3显示的是添加标准品后饮料的MRM色谱图，而图4则是加标回收实验的结果显示图。回收率高达99-103％。
根据这次研究的结果显示，使用Wakopak® Ultra APDS TAG® 进行APDS衍生化的氨基酸定量检测是有效的。虽然这次推出的结果仅限于饮料，但对于分析其他食品和培养液等样品也是有用的，欢迎采购此产品用于定量分析氨基酸。
表１．LC/MS/MS条件
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设备 |
Prominence LC-20A XR（岛津公司） |
|
柱 |
Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1×100 mm（W） |
|
防护过滤器 |
SunShell RP防护过滤器（Cromanic Technologies） |
|
流动相A |
APDS TAG® 洗脱液 |
|
流动相B |
60％乙腈 |
|
梯度条件 |
0min（. A：B=94：6）→0.05min.（. 92：8）→1.70min.（92：8） →1.71min.（88：12）→4.95min.（70：30）→5.95min.（40：60）→5.96min.（5：95）→6.70min.（5：95）→6.71min.（94：6）→12min.（94：6） |
|
流量 |
0.3 mL/min. |
|
柱温 |
40 ℃ |
|
注射量 |
1μL |
|
设备 |
LCMS-8030 Plus（岛津公司） |
|
电离 |
ESI positive |
|
测量模式 |
MRM |
|
DL温度 |
250 ℃ |
|
雾化器气体流量 |
1.5 L/min. |
|
加热块温度 |
250 ℃ |
|
干燥气体流量 |
10 L/min. |
|
No. |
组件名称（简称） |
分子量 |
监测因子（m / z） |
|
|
前体 |
制品 |
|||
|
1 |
甘氨酸（Gly） |
75.1 |
196.1 |
121.0 |
|
2 |
甘氨酸-13C2，15N（Gly-IS） |
78.1 |
199.1 |
121.1 |
|
3 |
丙氨酸（Ala） |
89.1 |
210.1 |
121.0 |
|
4 |
丙氨酸-13C3（Ala-IS） |
92.1 |
213.1 |
121.1 |
|
5 |
缬氨酸（Val） |
117.2 |
238.1 |
121.0 |
|
6 |
缬氨酸-13C5, 15N（Val-IS） |
123.1 |
244.1 |
121.1 |
|
7 |
亮氨酸（Leu） |
131.2 |
252.1 |
121.0 |
|
8 |
异亮氨酸（Ile） |
131.2 |
252.1 |
121.0 |
|
9 |
亮氨酸-5,5,5-d3（Leu-IS） |
134.2 |
255.1 |
121.1 |
|
10 |
异亮氨酸-13C6,15N（Ile-IS） |
138.1 |
259.1 |
121.1 |
|
11 |
精氨酸（精氨酸） |
174.2 |
295.1 |
175.1 |
|
12 |
精氨酸-15N4（Arg-IS） |
178.2 |
299.1 |
179.1 |
|
13 |
肌氨酸（Sar） |
89.1 |
210.0 |
121.0 |
|
14 |
羟脯氨酸（Hypro） |
131.1 |
252.1 |
121.0 |
|
15 |
天冬酰胺（Asn） |
132.1 |
253.1 |
121.0 |
|
16 |
天冬氨酸（Asp） |
133.1 |
254.1 |
121.0 |
|
17 |
谷氨酰胺（Gln） |
146.1 |
267.1 |
121.0 |
|
18 |
谷氨酸（Glu） |
147.1 |
268.1 |
121.0 |
|
19 |
α-氨基己二酸（α-AAA） |
161.2 |
282.1 |
121.0 |
|
20 |
瓜氨酸（Cit） |
175.2 |
296.3 |
121.0 |
图2.市售饮料中6种氨基酸成分的MRM色谱图
图3.添加标准品后饮料的MRM色谱图
图4.加标回收实验的结果显示图
<致谢>感谢味之素股份有限公司的每一位同仁对本产品的合作。
Wako Pack® Ultra APDS Tag®通用LC / MS可以实现高灵敏度和高速氨基酸分析。
◆产品列表
|
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
|
235-63973 |
Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1mm × 100mm（ W） |
1支 |
◆相关产品
|
产品编号 |
产品名称 |
标准/制造商 |
规格 |
|
014-23841 |
Amino Acid Analysis Reagent (for LC/MS) (AminoTag(R)) 氨基酸分析试剂 （用于LC/MS） |
用于氨基酸自动分析 |
100mg |
|
011-14463 |
Amino Acids Mixture Standard Solution, Type AN-2 氨基酸混合标准溶液, AN-2型 |
用于氨基酸自动分析 |
1mL×5A 5mL |
|
015-14461 |
|||
|
012-08643 |
Amino Acids Mixture Standard Solution, Type B 氨基酸混合标准溶液, B型 |
用于氨基酸自动分析 |
1mL×5A 5mL |
|
016-08641 |
|||
|
019-08393 |
Amino Acids Mixture Standard Solution, Type H 氨基酸混合标准溶液, H型 |
用于氨基酸自动分析 |
1mL×5A 5mL |
|
013-08391 |
|||
|
293-73701 |
APDS TAG® Wako Amino Acids Internal Standard Mixture Solution |
用于氨基酸自动分析 |
1套 |
|
010-23061 |
APDS Tag Wako Eluent APDS标签洗提液 |
用于氨基酸自动分析 |
1L |
|
019-23151 |
APDS Tag Wako Borate Buffer APDS标签硼酸盐缓冲液 |
用于氨基酸自动分析 |
1L |
|
380-04131 |
SunShell RP Guard Filter Starter kit （a holder, a cartridge, a tubing） |
Cromic技术 |
1套 |
[参考文献]
[1] 味の素株式会社 編：「アミノ酸ハンドブック」 （工業調査会）（2003）.
[2] 大澤 俊彦：化学と生物，44 （6），406 （2006）.
[3] 和田 他：分析化学，65 （6），301 （2016）.
[4] 湯田 直樹：健康・栄養食品研究，16 （1），1 （2017）.
[5] 特許第 4453363 号．
[6] 宮野 博：和光純薬時報，79 （1），2 （2011）.
[7] 今泉 明：化学と生物，53 （3），192 （2015）.
[8] 渡邊 他：島津評論，69 （1・2），47 （2012）.
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