利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量 检测氨基酸饮料的氨基酸


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利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量  检测氨基酸饮料的氨基酸利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量

检测氨基酸饮料的氨基酸


和光纯药工业株式会社 试剂化学实验室 須藤 勇紀

◆前言


  自从天冬酰胺在1806年从芦笋汁中分离成功以来,人们开始发现氨基酸,并将其大致分为四类,即作为营养物质的利用,作为味道成分的利用,生理作用的利用,反应性的利用,这些功能在我们生活中是不可缺少的 1)。另外,在动物体内无法合成的氨基酸既是动物的必需氨基酸,也是很重要的食物营养素。

  在日本实施的1991年特定保健食品体系、2002年保健功能食品体系、2015年功能性食品体系过程中,也是期待着将氨基酸作为保健品用于国民自我治疗药物的实践中 2,3)。功能性标示食品制度因其呈报制度更便于新企业参与。2017年3月特定保健用食品的数量为1,127件,功能性标示食品从以往的815件正在急剧增加中。从而可预计保健食品市场将迅速扩大。氨基酸作为营养素的功能已被广泛认可,以饮料,健康饮料,果冻等多种形态的氨基酸的食品流通于市场中 1),未来也将继续推出更多含有氨基酸的新型食品。



◆3-氨基吡啶-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(APDS)衍生化


  高效液相色谱法(HPLC)中的氨基酸分析衍生化技术是很久以前便存在的,因此市面上也存在许多种类的衍生剂,其中包括茚三酮和邻苯二甲醛。本次介绍的APDS氨基酸衍生化技术是一种具有高疏水性,且因其高电离效率更有利于反相LC/MS(/MS)的方法。

  该方法不仅用于味之素株式会社的“Amino index® 癌症风险筛选”(AICS)7)。在食品分析中也用于氨基酸分析专用装备(UF-Amino Station)的分析案例 8)

  Wakopak® Ultra APDSTAG® 是一种专用分析柱,可利用LC / MS / MS仪器对APDS-氨基酸衍生物进行分离分析。本次我们介绍的是使用该柱分析市售氨基酸饮料中的氨基酸种类。


利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量  检测氨基酸饮料的氨基酸

◆实验方法和结果分析


  样品前处理和衍生化的流程如图1所示,LC / MS / MS条件如表1所示。 定量采用内标法进行。在这次实验的饮料中,据材料记载氨基酸种类含有甘氨酸(Gly),丙氨酸(Ala),缬氨酸(Val),亮氨酸(Leu),异亮氨酸(Ile)和精氨酸(Arg)这六种种类,但市售饮料中都不含表1的No.13〜20的氨基酸类。图2显示的是市售饮料中的6种氨基酸的MRM色谱分析图。接下来,将氨基酸标准品加入到获得该色谱的样品中,并进行回收实验。图3显示的是添加标准品后饮料的MRM色谱图,而图4则是加标回收实验的结果显示图。回收率高达99-103%。

  根据这次研究的结果显示,使用Wakopak® Ultra APDS TAG® 进行APDS衍生化的氨基酸定量检测是有效的。虽然这次推出的结果仅限于饮料,但对于分析其他食品和培养液等样品也是有用的,欢迎采购此产品用于定量分析氨基酸。


表1.LC/MS/MS条件

设备

Prominence LC-20A XR(岛津公司)

Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1×100 mm(W)

防护过滤器

SunShell RP防护过滤器(Cromanic   Technologies)

流动相A

APDS TAG® 洗脱液

流动相B

60%乙腈

梯度条件

0min(. A:B=94:6)→0.05min.(. 92:8)→1.70min.(92:8)   →1.71min.(88:12)→4.95min.(70:30)→5.95min.(40:60)→5.96min.(5:95)→6.70min.(5:95)→6.71min.(94:6)→12min.(94:6)

流量

0.3 mL/min.

柱温

40 ℃

注射量

1μL

 

设备

LCMS-8030 Plus(岛津公司)

电离

ESI positive

测量模式

MRM

DL温度

250 ℃

雾化器气体流量

1.5 L/min.

加热块温度

250 ℃

干燥气体流量

10 L/min.

 

No.

组件名称(简称)

分子量

监测因子(m / z)

前体

制品

1

甘氨酸(Gly)

75.1

196.1

121.0

2

甘氨酸-13C2,15N(Gly-IS)

78.1

199.1

121.1

3

丙氨酸(Ala)

89.1

210.1

121.0

4

丙氨酸-13C3(Ala-IS)

92.1

213.1

121.1

5

缬氨酸(Val)

117.2

238.1

121.0

6

缬氨酸-13C5,   15N(Val-IS)

123.1

244.1

121.1

7

亮氨酸(Leu)

131.2

252.1

121.0

8

异亮氨酸(Ile)

131.2

252.1

121.0

9

亮氨酸-5,5,5-d3(Leu-IS)

134.2

255.1

121.1

10

异亮氨酸-13C6,15N(Ile-IS)

138.1

259.1

121.1

11

精氨酸(精氨酸)

174.2

295.1

175.1

12

精氨酸-15N4(Arg-IS)

178.2

299.1

179.1

13

肌氨酸(Sar)

89.1

210.0

121.0

14

羟脯氨酸(Hypro)

131.1

252.1

121.0

15

天冬酰胺(Asn)

132.1

253.1

121.0

16

天冬氨酸(Asp)

133.1

254.1

121.0

17

谷氨酰胺(Gln)

146.1

267.1

121.0

18

谷氨酸(Glu)

147.1

268.1

121.0

19

α-氨基己二酸(α-AAA)

161.2

282.1

121.0

20

瓜氨酸(Cit)

175.2

296.3

121.0

 

利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量  检测氨基酸饮料的氨基酸

图2.市售饮料中6种氨基酸成分的MRM色谱图

 

利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量  检测氨基酸饮料的氨基酸

图3.添加标准品后饮料的MRM色谱图


利用Wakopak® Ultra APDSTAG® 定量  检测氨基酸饮料的氨基酸

图4.加标回收实验的结果显示图


<致谢>感谢味之素股份有限公司的每一位同仁对本产品的合作。

 Wako Pack® Ultra APDS Tag®通用LC / MS可以实现高灵敏度和高速氨基酸分析。

◆产品列表


产品编号

产品名称

包装

235-63973

Wakopak® Ultra APDS TAG® φ2.1mm × 100mm( W)

1支

 


◆相关产品


产品编号

产品名称

标准/制造商

规格

014-23841

Amino Acid Analysis Reagent (for LC/MS) (AminoTag(R))

氨基酸分析试剂

(用于LC/MS)

用于氨基酸自动分析

100mg

011-14463

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type AN-2

氨基酸混合标准溶液, AN-2型

用于氨基酸自动分析

1mL×5A 5mL

015-14461

012-08643

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type B

氨基酸混合标准溶液, B型

用于氨基酸自动分析

1mL×5A 5mL

016-08641

019-08393

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type H

氨基酸混合标准溶液, H型

用于氨基酸自动分析

1mL×5A 5mL

013-08391

293-73701

APDS TAG® Wako Amino Acids Internal   Standard Mixture Solution

用于氨基酸自动分析

1套

010-23061

APDS Tag Wako Eluent

APDS标签洗提液

用于氨基酸自动分析

1L

019-23151

APDS Tag Wako Borate Buffer

APDS标签硼酸盐缓冲液

用于氨基酸自动分析

1L

380-04131

SunShell RP Guard Filter Starter kit 

(a holder, a cartridge, a tubing)

Cromic技术

1套

 

[参考文献]

[1] 味の素株式会社 編:「アミノ酸ハンドブック」 (工業調査会)(2003).

[2] 大澤 俊彦:化学と生物,44 (6),406 (2006).

[3] 和田 他:分析化学,65 (6),301 (2016).

[4] 湯田 直樹:健康・栄養食品研究,16 (1),1 (2017).

[5] 特許第 4453363 号.

[6] 宮野 博:和光純薬時報,79 (1),2 (2011).

[7] 今泉 明:化学と生物,53 (3),192 (2015).

[8] 渡邊 他:島津評論,69 (1・2),47 (2012).

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